基于便攜式掃描儀與智能手機(jī)的尿酸定量檢測(cè)技術(shù)

侯鵬飛，張校亮，譚 慷，李曉春

(太原理工大學(xué) a.物理與光電工程學(xué)院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024)

尿酸是人體內(nèi)嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，健康成年人血清中正常的尿酸水平為2.5～6.72 mg/dL.尿酸水平降低往往與艾滋病、糖尿病等有關(guān)，而尿酸水平過(guò)高(高尿酸血癥)可能導(dǎo)致痛風(fēng)、腎病等疾病[1-2]。尿酸作為一項(xiàng)重要的人體生理指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)不僅可以用于疾病的診斷，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)人體健康狀況的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，有助于預(yù)防疾病的進(jìn)一步惡化。到目前為止，人們已經(jīng)研發(fā)出多種尿酸的檢測(cè)方法比如高效液相色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]以及熒光光譜法[5]等。但這些技術(shù)往往需要精密的大型儀器輔助，檢測(cè)成本高，且操作復(fù)雜，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。臨床常用的尿酸檢測(cè)方法是磷鎢酸還原法，具體的檢測(cè)原理是無(wú)蛋白濾液中的尿酸在堿性環(huán)境中可以被磷鎢酸氧化成尿囊素和二氧化碳，而磷鎢酸被還原成顯藍(lán)色的鎢藍(lán)，利用分光光度計(jì)檢測(cè)710 nm處的吸收峰峰值，通過(guò)計(jì)算吸光度值的方法以實(shí)現(xiàn)尿酸的定量檢測(cè)。磷鎢酸還原法是一種穩(wěn)定且準(zhǔn)確的尿酸分析方法，不易受到血清中膽紅素等物質(zhì)的干擾，具有較強(qiáng)的抗干擾能力[6]。但目前此方法在使用時(shí)同樣需要依賴分光光度計(jì)等專業(yè)設(shè)備，很難普及到普通用戶家中，也很難應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)中。因此，目前仍缺乏適用于現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)人體血尿酸的方法。

比色分析作為一種方便準(zhǔn)確的技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在檢測(cè)領(lǐng)域中，包括常見(jiàn)的尿液試紙條[7]、水質(zhì)檢測(cè)卡[8]等。使用者通過(guò)人眼直接觀察或者使用顏色分析軟件對(duì)待測(cè)樣品的色度值進(jìn)行分析來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢物的定性分析或定量檢測(cè)。為了提高比色分析的檢測(cè)精度與檢測(cè)速度，人們逐漸將電子產(chǎn)品應(yīng)用其中，即利用電子設(shè)備獲取高質(zhì)量的圖片，并對(duì)顯色圖像進(jìn)行色度學(xué)定量分析。目前，人們已經(jīng)通過(guò)使用數(shù)碼相機(jī)[9]、智能手機(jī)[7]、網(wǎng)絡(luò)攝像頭[10]等電子產(chǎn)品進(jìn)行拍照分析，但這些設(shè)備存在的共同問(wèn)題是在拍照過(guò)程中無(wú)法避免環(huán)境光對(duì)成像的影響，因而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確、不穩(wěn)定的問(wèn)題。比較之下，掃描儀因可以提供密閉空間以及均勻光源的優(yōu)勢(shì)而被逐漸更多地應(yīng)用于比色分析之中。

光學(xué)掃描儀在成像時(shí)可以避免環(huán)境光的干擾，此外固定且均勻的白光LED光源接近日照光，使得成像更加清晰準(zhǔn)確。檢測(cè)者可以將96微孔板、試紙條、微流控芯片等放置于臺(tái)式掃描儀的密閉空間中實(shí)現(xiàn)掃描成像并達(dá)到定量檢測(cè)的目的。2009年，SOLDAT et al[11]通過(guò)用臺(tái)式掃描儀對(duì)96微孔板中顯色溶液的掃描及分析實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷酸鹽等鹽溶液濃度的定量檢測(cè)。同樣2014年，CAMILO et al[12]將葡萄糖、肌酸酐以及甘油三酯顯色反應(yīng)后的產(chǎn)物滴加在64微孔板中，結(jié)合臺(tái)式掃描儀實(shí)現(xiàn)了葡萄糖等三種物質(zhì)的定量檢測(cè)。但臺(tái)式掃描儀結(jié)合微孔板的方法有一個(gè)明顯的不足就是微孔板對(duì)掃描儀內(nèi)部空間有較大的要求，這使得普通辦公室掃描儀很難滿足條件。2015年，MENG et al[13]利用PC(聚碳酸酯)和透明PDMS(聚二甲基硅氧烷)開(kāi)發(fā)了新的薄片載體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蘋(píng)果中馬拉硫磷農(nóng)殘的定量檢測(cè)，該方法減小了待測(cè)液載體的體積，使得普通辦公室掃描儀也可用于比色分析的成像中。2018年，LEE et al[14]進(jìn)一步改善了待測(cè)液的載體，將濾紙芯片用作檢測(cè)液載體，結(jié)合臺(tái)式掃描儀實(shí)現(xiàn)了人體前列腺癌細(xì)胞中H2S的定量檢測(cè)。然而，此方法雖然減小了待測(cè)液載體的體積與成本，但仍依賴于體積較大的臺(tái)式掃描儀對(duì)其進(jìn)行掃描，并且依靠計(jì)算機(jī)對(duì)獲取的圖片進(jìn)行分析及結(jié)果顯示，這使得此檢測(cè)方法及裝置的便攜性降低，仍然無(wú)法廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)中。因此，解決此問(wèn)題最重要的辦法是減小設(shè)備體積并簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)處理的過(guò)程。隨著人們對(duì)掃描儀的研究與改進(jìn)，CIS(contact image sensor)便攜式掃描儀被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用。不同于采用CCD(電荷耦合元件)的臺(tái)式掃描儀，CIS便攜式掃描儀的光電傳感器的長(zhǎng)度與成像區(qū)域長(zhǎng)度一致，且CIS便攜式掃描儀的景深較小，因此在成像過(guò)程中，CIS便攜式掃描儀距離掃描對(duì)象更近。正因如此，CIS便攜式掃描儀無(wú)需自帶密閉空間便可以避免環(huán)境光的影響[15]。另外，部分CIS便攜式掃描儀內(nèi)置了Wi-Fi模塊，可以通過(guò)Wi-Fi實(shí)現(xiàn)與手機(jī)、計(jì)算機(jī)等電子設(shè)備的圖像傳輸，減小了掃描系統(tǒng)的體積并縮短了圖像傳輸?shù)臅r(shí)間。因此將CIS便攜式掃描儀用于比色分析有很大的意義。

基于此，本研究使用了CIS便攜式掃描儀用于獲取高質(zhì)量圖像，并設(shè)計(jì)了適用于便攜式掃描儀的濾紙芯片，結(jié)合數(shù)字圖片比色法以及磷鎢酸還原法，將掃描儀獲取的圖像通過(guò)Wi-Fi傳輸至智能手機(jī)進(jìn)行分析并顯示最終的檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了對(duì)尿酸的快速定量檢測(cè)。此方法不僅避免了尿酸檢測(cè)對(duì)大型儀器的依賴，顯著提高了檢測(cè)方法的簡(jiǎn)易性，而且對(duì)醫(yī)院提供的樣本的檢測(cè)結(jié)果與紫外分光光度法得到的檢測(cè)結(jié)果基本一致，證明此方法具有較高的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

尿酸檢測(cè)試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)，主要成分有尿酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液、鎢酸蛋白沉淀劑、CUT試劑和磷鎢酸試劑(CUT是一種混合溶液，其中含有碳酸鈉、硫代氨基脲等，其作用是一種促進(jìn)劑，讓尿酸在堿性的環(huán)境中更加充分地還原磷鎢酸)；Whatman定性3號(hào)濾紙，Whatman纖維素層析1號(hào)濾紙(上海金畔生物科技有限公司)。

漢王E摘客便攜式掃描儀；華為暢享7 Plus智能手機(jī)；尼康COOLPIX P 310數(shù)碼相機(jī)；EPSON噴墨打印機(jī)；VCA Optima接觸角儀；中科中佳HC-2518離心機(jī)；Pipet-Lite XLS手動(dòng)單道移液槍；UV-3100-紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；TKA Genpure UV超純水系統(tǒng)(美國(guó)賽默飛世爾公司)。

1.2 濾紙芯片的設(shè)計(jì)及制作

CIS便攜式掃描儀在掃描承載液體的載體時(shí)需要接觸載體本身，如果用便攜式掃描儀直接對(duì)顯色后的試紙條等接觸，會(huì)導(dǎo)致掃描儀接觸載體中的液體試劑從而影響最終的分析結(jié)果，而且會(huì)對(duì)掃描儀造成污染。為解決在掃描過(guò)程中掃描儀會(huì)接觸試劑的問(wèn)題，同時(shí)也為了提高紙基的利用率并且減少制作中的復(fù)雜程度和成本，本文設(shè)計(jì)了專用的濾紙芯片。首先在計(jì)算機(jī)上的CorelDRAW軟件中，設(shè)計(jì)好濾紙芯片各部分的形狀，用噴墨打印機(jī)將設(shè)計(jì)好的形狀打印在濾紙上，然后用剪刀與打孔器沿著打印的圖形進(jìn)行裁剪。設(shè)計(jì)的濾紙芯片如圖1所示，濾紙芯片由4層長(zhǎng)度為160 mm，寬度為30 mm的濾紙組成，頂部?jī)蓪訛榄h(huán)形的隔離層，中間鏤空區(qū)域長(zhǎng)140 mm，寬10 mm，隔離層用于隔離掃描儀與液體試劑；第三層為顯色區(qū)，中間的圓片為反應(yīng)顯色區(qū)，由打孔器(孔徑d=8 mm)裁剪濾紙得到，顯色后的試劑將滴加在中間圓片上參與之后的分析；底層為襯底層，用于避免液體試劑外漏。四層濾紙由噴膠粘合在一起。另外，整個(gè)濾紙芯片除圓片顯色區(qū)外的部分均經(jīng)過(guò)疏水化處理。具體的疏水化處理過(guò)程如下：將十八烷基三氯硅烷(OTS)與甲基三氯硅烷(MTS)按體積比為3∶7混合形成疏水化試劑，將除圓片顯色區(qū)外的部分浸泡在疏水化試劑中5 min，之后室溫下風(fēng)干。疏水處理后，使用接觸角儀測(cè)量濾紙的表面水接觸角θ驗(yàn)證疏水效果，將疏水后的濾紙與圓片顯色區(qū)用噴膠依次粘合便可實(shí)現(xiàn)濾紙芯片的制作。

圖1 濾紙芯片制作示意圖

1.3 檢測(cè)原理

本文使用了自帶Wi-Fi模塊的CIS便攜式掃描儀進(jìn)行圖像掃描，實(shí)驗(yàn)中用到了磷鎢酸還原法的顯色原理[6]。具體操作流程及檢測(cè)原理如下。首先，配制質(zhì)量濃度分別為0，1，3，5，7，9，10 mg/dL的尿酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，并取出待檢樣品。向100 μL的標(biāo)準(zhǔn)樣和待測(cè)樣中加入鎢酸蛋白沉淀劑1 000 μL，混勻，10 min后以3 000 r/min的速度離心5 min.取上清液480 μL，加入CUT試劑150 μL，再加入磷鎢酸試劑150 μL，混勻后，靜置10 min.隨后將顯色后的標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)液取出30 μL滴加在濾紙芯片上的顯色區(qū)域。使用便攜式掃描儀完成對(duì)濾紙芯片的掃描，并將獲取得到的電子圖片通過(guò)自帶的Wi-Fi模塊傳輸至智能手機(jī)。利用Java語(yǔ)言自主開(kāi)發(fā)了可獲取圖片色度值的手機(jī)應(yīng)用程序，該應(yīng)用程序可以獲取顯色區(qū)域的色度值并進(jìn)行分析。分析過(guò)程中，智能手機(jī)首先利用最小二乘法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度值與色度值建立線性擬合方程，然后將待測(cè)樣的色度值代入擬合方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度值，并將結(jié)果顯示到手機(jī)界面，從而實(shí)現(xiàn)了待測(cè)樣尿酸的定量檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾紙芯片中濾紙類型的選擇

目前常用于比色分析的濾紙類型有Whatman定性3號(hào)濾紙(Grade 3)與Whatman纖維素層析1號(hào)濾紙(Chr 1)，兩者的厚度與材料等均不相同，為了探究適用于本方法的濾紙，本文將兩種濾紙均用于尿酸分析并進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，在0 ～ 10 mg/dL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，定性3號(hào)濾紙芯片中Red值與尿酸質(zhì)量濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，而纖維素層析1號(hào)濾紙芯片中Red值在尿酸質(zhì)量濃度超過(guò)8 mg/dL時(shí)已經(jīng)達(dá)到飽和，這主要是濾紙厚度不同造成的，纖維素層析1號(hào)濾紙較薄(180 μm)，當(dāng)?shù)渭佣康纳钌噭r(shí)更容易達(dá)到飽和，相比之下，定性3號(hào)濾紙(390 μm)的分析結(jié)果呈現(xiàn)的線性范圍更寬。因此，最終選擇Whatman定性3號(hào)濾紙(Grade 3)制作濾紙芯片，且定性3號(hào)濾紙經(jīng)疏水化處理后，測(cè)得的表面水接觸角θ為140 °±5 °，達(dá)到了預(yù)期的疏水化效果。

圖2 纖維素層析1號(hào)濾紙與定性3號(hào)濾紙檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

2.2 現(xiàn)有電子產(chǎn)品成像質(zhì)量的對(duì)比

目前研究者們已經(jīng)將智能手機(jī)、數(shù)碼相機(jī)等電子設(shè)備運(yùn)用于比色分析的圖像獲取中，為了對(duì)比便攜式掃描儀與幾種現(xiàn)有常見(jiàn)電子產(chǎn)品的成像質(zhì)量，本文對(duì)其所獲得的圖片進(jìn)行了數(shù)字化分析。選擇了與尿酸顯色反應(yīng)產(chǎn)物鎢藍(lán)顏色接近的且顏色深度按梯度變化的藍(lán)色圓點(diǎn)作為分析對(duì)象，用智能手機(jī)、數(shù)碼相機(jī)及便攜式掃描儀分別對(duì)其進(jìn)行成像，然后在Adobe Photoshop CC 2015.5中獲取每個(gè)點(diǎn)的Red值，并與預(yù)設(shè)Red值進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖3所示，對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，用手機(jī)及相機(jī)拍攝的照片具有明顯的背景色，且整體圖片偏暗，而便攜式掃描儀得到的圖片背景明顯接近于原始設(shè)計(jì)圖，這是因?yàn)槭謾C(jī)與相機(jī)在拍照時(shí)會(huì)受到環(huán)境光影響，而便攜式掃描儀可以避免環(huán)境光影響；從色度值分析結(jié)果中也可看出，手機(jī)與相機(jī)成像得到的部分Red值與理論值有較大偏差，而便攜式掃描儀可以獲得與預(yù)設(shè)值相接近的測(cè)定值，且線性關(guān)系與虛線表示的理論關(guān)系基本一致。從而證明了將CIS便攜式掃描儀用于比色分析的可行性。

圖3 常見(jiàn)電子產(chǎn)品成像質(zhì)量的對(duì)比及比色分析

2.3 色度值的選擇

本文對(duì)尿酸的檢測(cè)是通過(guò)色度值與濃度值的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)的，因此色度值的選擇對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義。RGB色度空間作為一種常用色度空間多用于對(duì)顏色的表征，包含Red、Green、Blue三種色度值。為了從RGB色度空間中確定用于檢測(cè)尿酸的色度值，本文首先配置了質(zhì)量濃度分別為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 mg/dL的尿酸標(biāo)準(zhǔn)品，在完成顯色反應(yīng)后，將30 μL試劑滴加到濾紙芯片的顯示區(qū)上，使用便攜式掃描儀進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果如圖4(a)所示，隨后將圖片傳輸至智能手機(jī)，利用智能手機(jī)計(jì)算顯色區(qū)的Red、Green、Blue三個(gè)色度值，并建立濃度值與三個(gè)色度值的線性關(guān)系。對(duì)比之后發(fā)現(xiàn)，Red值與濃度值的線性擬合系數(shù)最高，達(dá)到了0.996 0，如圖4(b)所示，這意味著Red值對(duì)尿酸濃度的變化更敏感，用Red值建立得到的擬合方程計(jì)算尿酸濃度時(shí)檢測(cè)結(jié)果也會(huì)更準(zhǔn)確，因此選擇Red值作為檢測(cè)尿酸的分析色度值。另外，Red值與尿酸濃度值之間的擬合方程為y=-4.677 3x+252.289 7，通過(guò)擬合方程及3σ/b原則(其中σ是擬合方程中截距的標(biāo)準(zhǔn)方差，b是擬合方程的斜率)計(jì)算得到本方法的尿酸檢測(cè)限為0.8 mg/dL.

圖4 尿酸顯色后掃描圖及濃度值與三種色度值的線性關(guān)系

2.4 與分光光度方法的對(duì)比及驗(yàn)證

為了進(jìn)一步探究本方法的準(zhǔn)確性，本文將此方法與分光光度方法進(jìn)行了對(duì)比。首先是標(biāo)準(zhǔn)樣檢測(cè)的對(duì)比，將質(zhì)量濃度分別為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 mg/dL的尿酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行顯色后用便攜式掃描儀與分光光度計(jì)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，探究二者所得Red值與吸光度值的線性關(guān)系。隨著尿酸濃度的增大，Red值逐漸變小，而吸光度值逐漸增加，所得對(duì)比結(jié)果如圖5所示，本方法與分光光度法方法的擬合系數(shù)達(dá)到了0.984 5，說(shuō)明兩種方法顯示隨著尿酸濃度的增大，吸光度值與Red值具有一致的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。

圖5 分光光度計(jì)與便攜式掃描儀檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性

此外，本文對(duì)實(shí)際樣品在兩方法下進(jìn)行了檢測(cè)及對(duì)比。樣品采用在山西白求恩醫(yī)院取得的10組血清樣本，分別用分光光度法與便攜式掃描儀檢測(cè)尿酸的濃度并進(jìn)行對(duì)比，采用直接測(cè)量的方式，具體的操作過(guò)程與標(biāo)準(zhǔn)樣品操作過(guò)程相同，最終的檢測(cè)結(jié)果及對(duì)比如圖6所示。從圖中可以看出，10組檢測(cè)結(jié)果中，利用本方法檢測(cè)所得到的尿酸濃度與分光光度法得到的尿酸濃度值表現(xiàn)出較高的一致性，從而證明了開(kāi)發(fā)的基于便攜式掃描儀結(jié)合智能手機(jī)以及濾紙芯片的尿酸濃度定量檢測(cè)方法的可靠性與準(zhǔn)確性。

圖6 便攜式掃描儀體系與分光光度計(jì)對(duì)人體血清樣本檢測(cè)結(jié)果比較

3 結(jié)論

本文基于便攜式掃描儀和智能手機(jī)實(shí)現(xiàn)了人體內(nèi)尿酸的定量檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到了0.8 mg/dL.為了解決CIS便攜式掃描儀在掃描過(guò)程中會(huì)接觸載體中液體試劑的問(wèn)題，設(shè)計(jì)并制作了適用于便攜式掃描儀的濾紙芯片。本文還對(duì)比了兩種常用于比色分析的濾紙，選擇了適用于本方法的濾紙制作濾紙芯片。在此基礎(chǔ)上，對(duì)比了Red、Green、Blue三種色度值與尿酸濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，選擇了線性關(guān)系最好的Red值作為檢測(cè)尿酸的色度值，并將Red值與分光光度計(jì)的吸光度值進(jìn)行對(duì)比，證明具有較高的相關(guān)性。最后，本文還對(duì)實(shí)際血清樣品中的尿酸進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與分光光度法檢測(cè)結(jié)果基本一致，表明該方法可以用于人體尿酸的定量檢測(cè)。此檢測(cè)系統(tǒng)無(wú)需依賴大型儀器，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，具有廣泛的應(yīng)用前景。