膽暢心寬茶對(duì)小鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成影響的實(shí)驗(yàn)研究

沈惟一 劉兆娜 姚依影 胡海 王毅興

摘 要 目的：探究膽暢心寬茶對(duì)小鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成影響及潛在機(jī)制。方法：給予小鼠普通飼料+/-膽暢心寬茶以及成石飼料+/-膽暢心寬茶，每組9只。喂養(yǎng)4周后處死采集血清、膽囊膽汁、肝臟等標(biāo)本做檢測(cè)。結(jié)果：?jiǎn)渭兂墒暳辖M小鼠，膽囊內(nèi)均出現(xiàn)肉眼結(jié)石以及鏡下膽固醇結(jié)晶100%，而成石飼料加茶組肉眼結(jié)石只有44%，鏡下膽固醇結(jié)晶78%。在普通飼料及成石飼料、飲茶小鼠膽汁中β-鼠膽酸比例均顯著增高。成石飼料加茶組，肝臟膽汁酸代謝相關(guān)基因Cyp8b1表達(dá)下降，Cyp2c70表達(dá)上升。結(jié)論：膽暢心寬茶能預(yù)防膽囊膽固醇結(jié)晶/結(jié)石形成，可能與促進(jìn)β-鼠膽酸合成，提高膽汁中膽汁酸親水性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 膽石病 膽固醇 中藥

中圖分類號(hào)：R286； R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2021）03-0063-05

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目“茵陳蒿湯阻斷毒性膽汁酸對(duì)SCF/c-kit通路的影響治療膽石癥的研究”（81603560）；浦東新區(qū)衛(wèi)健委臨床中醫(yī)高峰學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（PDZY-2018-0603）

Experimental study on the effect of Danchangxinkuan tea on cholesterol gallstone formation in mice*

SHEN Weiyi1， LIU Zhaona1， YAO Yiying1， HU Hai1**， WANG Yixing2***（1. Center of Gallbladder Disease； 2. Department of Traditional Chinese Medicine， Shanghai East Hospital affiliated to Tongji University， Shanghai 201200， China）

ABSTRACT Objective： To explore the potential mechanism and the effect of Danchangxinkuan tea on the formation of cholesterol gallstones in mice. Methods： Nine mice in each group were given chow diet +/- tea or lithogenic diet +/- tea. After 4 weeks of feeding， mice were sacrificed to collect serum， gallbladder bile， liver and other specimens for testing. Results： Gross stones and cholesterol crystals found in the gallbladder of all mice accounted for 100% in the lithogenic diet group when observed by naked eyes or under the microscope， only 44% （by naked eyes） and 78% （under the microscope） in the lithogenic diet plus tea group. The ratio of β-murocholic acid in the bile of tea-drinking mice was significantly increased in both diets. The expression of liver bile acid metabolism-related gene Cyp8b1 decreased while the expression of Cyp2c70 increased in lithogenic diet plus tea group. Conclusion： Danchangxinkuan tea can prevent gallbladder cholesterol crystals/stone formation， which may be related to the promotion of β-murocholic acid synthesis and the improvement of hydrophilicity of cholic acid in bile.

KEY WORDS gallstone； cholesterol； traditional Chinese medicine

膽囊膽固醇結(jié)石?。ê?jiǎn)稱：膽石病）是臨床常見疾病，約90%為膽固醇結(jié)石[1]。目前研究認(rèn)為其發(fā)生有關(guān)的病理生理異常包括：①肝臟向膽汁中分泌過多膽固醇；②膽汁中膽汁酸和磷脂相對(duì)不足；或兩者兼有，導(dǎo)致膽汁中膽固醇的溶解平衡被破壞，膽固醇結(jié)晶容易形成進(jìn)而發(fā)展成膽固醇結(jié)石[2]。

茶、麥芽等日常食品也被證明具有降血脂降膽固醇的作用，可能對(duì)膽石病具有一定的防治作用[3]，近期一項(xiàng)基于臺(tái)灣地區(qū)人口的調(diào)查顯示，適量的飲茶有助于降低膽囊結(jié)石的發(fā)病率[4]，進(jìn)一步證實(shí)了日常飲食一定程度上可預(yù)防膽囊結(jié)石的形成。膽暢心寬茶根據(jù)“膽病從肝論治”及“六腑以通為用、以降為順”的傳統(tǒng)中醫(yī)理論，以白茶，蒲公英等具有疏肝，利膽，理氣作用的中藥成分制成茶包。本研究擬通過小鼠膽囊膽固醇結(jié)石病模型，觀察膽暢心寬茶對(duì)于結(jié)石形成的預(yù)防作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)8周齡雄性C57BL/6J小鼠36只購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。Trizol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量PCR SYBR Green染料試劑盒均購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司。磷脂檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation?？偰懝檀荚噭┖匈?gòu)自上?？迫A生物。

膽暢心寬茶成分為白茶、茯苓、蒲公英、葛根、桔梗、麥芽、枸杞子、淡竹葉、玳玳花、枳棋子、重瓣紅玫瑰，由上海上海脈語方食品有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備

所有小鼠隨機(jī)分為4組（n=9只/組）：①普通飼料+飲用純凈水組（chow diet，CD組）；②普通飼料+飲用膽暢心寬茶（CT組）；③成石飼料+飲用純凈水（lithogenic diet，LD組）；④成石飼料+飲用膽暢心寬茶（LT組）。成石飼料配方為普通飼料加0.5%膽固醇+0.25%膽酸。膽暢心寬茶配制：3 g茶葉用100 ml沸水浸泡4 h。水或茶為隨意飲用。所有小鼠喂養(yǎng)4周后處死，采集血清、肝臟，觀察膽囊結(jié)石形成情況，及偏光顯微鏡下觀察膽固醇結(jié)晶。

1.2.2 肝臟基因表達(dá)的檢測(cè)

采用Trizol試劑法提取肝臟組織總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將2 mg RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并1∶10稀釋后，用定量PCR儀檢測(cè)基因表達(dá)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Gapdh）作為內(nèi)參。采用雙DeltaCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 膽汁成分測(cè)定

分別采用膽固醇試劑盒及磷脂檢測(cè)試劑盒測(cè)定膽汁中膽固醇及磷脂濃度含量。采用UPLC-MS測(cè)定膽汁酸成分。根據(jù)Carey表計(jì)算膽汁膽固醇飽和指數(shù)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠膽囊及膽結(jié)石觀察

成石情況見表1。LD組小鼠膽囊內(nèi)均渾濁，LT組2只小鼠外觀清澈透亮，無結(jié)晶/結(jié)石形成（圖1），4只可見結(jié)石形成，剩余3只僅在鏡下可見膽固醇結(jié)晶。偏光顯微鏡下LD、LT組觀察結(jié)果見圖2。

2.2 膽汁中膽汁酸組分比較

小鼠膽汁中膽汁酸成分見表2。普通飼料喂養(yǎng)下，CT組膽汁中膽酸（cholic acid，CA）比例較CD組下降，b-鼠膽酸（b-MCA）比例則上升（P<0.01）。成石飼料喂養(yǎng)下，上述差異趨勢(shì)依然存在，LT組b-鼠膽酸比例相較LD組上升（P<0.05）。飲用膽暢心寬茶的小鼠，膽汁中b-鼠膽酸與膽酸含量的比值升高（圖3）。

2.3 肝臟膽汁酸代謝通路相關(guān)酶的基因表達(dá)差異及肝臟損傷情況

普通飼料組小鼠，CD組與CT組兩組間膽汁酸合成通路的關(guān)鍵酶表達(dá)無顯著差異。成石飼料喂養(yǎng)小鼠，LT組較LD組膽汁酸代謝相關(guān)基因Cyp8b1表達(dá)下降（P<0.05），Cyp2c70表達(dá)量上升（P<0.01，圖4）。CT組對(duì)比CD組，LT組對(duì)比LD組，血清中轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST均未出現(xiàn)升高（結(jié)果未列出）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，飲用膽暢心寬茶具有降低小鼠膽囊膽固醇結(jié)晶/結(jié)石形成的作用。這種作用與飲用膽暢心寬茶調(diào)控肝臟膽汁酸合成關(guān)鍵酶表達(dá)，促進(jìn)b-MCA含量有關(guān)。

膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸是機(jī)體清除膽固醇的重要途經(jīng)，該過程僅在肝臟中發(fā)生。膽固醇首先由P450酶系中的7a-羥化酶（Cyp7a1）形成7a-羥化膽固醇，繼而通過12a-羥化酶（Cyp8b1）以7a-羥化膽固醇為底物，生成終產(chǎn)物膽酸（CA）。在小鼠中，細(xì)胞色素P450酶系2族C70（Cyp2c70）可將鵝去氧膽酸（CDCA）和熊去氧膽酸（UDCA）轉(zhuǎn)化生成b-鼠膽酸[6]。這些酶的活性決定了膽汁中各膽汁酸成分的比例[7]及膽汁酸的疏水性，而后者對(duì)于影響膽汁對(duì)膽固醇的溶解度[8]以及腸道膽固醇攝取具有重要作用。

本研究中發(fā)現(xiàn)LT組肝臟Cyp2c70表達(dá)上升，這與膽汁中b-鼠膽酸的比例增加有關(guān)。不論是普通飼料還是成石飼料，給予膽暢心寬茶的小鼠b-MCA含量以及b-MCA與CA的比值均高于對(duì)照組。Heuman[9]的研究發(fā)現(xiàn)，與?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合的b-MCA疏水指數(shù)分別為-0.78和-0.73，遠(yuǎn)低于CA（0，0.07）、CDCA（0.46，0.51）等常見膽汁酸。由此可見，膽暢心寬茶具有促進(jìn)Cyp2c70增加b-MCA合成及其在膽汁中比例，進(jìn)而預(yù)防結(jié)石形成。

此外，肝臟Cyp8表達(dá)下降與之相應(yīng)的CA也出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，這可能是膽暢心寬茶減少膽固醇結(jié)石的又一機(jī)制。Cyp8b1敲除的小鼠膽汁酸循環(huán)池更大，對(duì)于日常飲食中膽固醇和脂質(zhì)的吸收更少，并且更不易形成膽固醇結(jié)石[10]。Cyp8b1敲除后，小鼠完全喪失CA而b-MCA合成增加，即使給予成石飼料，其膽汁膽固醇飽和度顯著降低，且形成膽固醇結(jié)晶明顯減少[11]，這與本研究中的飲茶組小鼠效應(yīng)類似。

小腸中膽固醇的吸收對(duì)于維持機(jī)體膽固醇的平衡同樣重要，其中尼曼-匹克C1樣蛋白1（Npcil1）被認(rèn)為是膽固醇吸收中最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體之一。這種蛋白負(fù)責(zé)將腸道內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，而腸細(xì)胞吸收的膽酸和脫氧膽酸可通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，提高Npcil1的表達(dá)，增加膽固醇吸收[12]。另外，腸道膽固醇的吸收率會(huì)隨著外源飲食給予的膽汁酸親水性上升而下降，其原因可能是親水性膽汁酸降低腸腔內(nèi)微膠粒中膽固醇的溶解度，影響吸收。因此，降低膽汁膽鹽池的疏水性指數(shù)會(huì)降低小腸細(xì)胞對(duì)膽固醇的生物利用度。

除了上述通過膽汁酸成分改變影響結(jié)石形成的機(jī)制外，膽暢心寬茶可能在吸收或排泄膽固醇方面也有一定的效應(yīng)，其主要成分白茶富含的茶多酚被證明能影響脂質(zhì)膠粒的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)膽固醇的吸收[13]。另一方面，茶多酚或分泌的膽汁酸又可以充當(dāng)腸道法尼酯X受體（FXR）的激動(dòng)劑[14]，增加下游膽固醇經(jīng)腸道排泄（TICE）的量，減少膽固醇的吸收[15]。茶多酚也可以直接減少腸道膽汁酸的再吸收，從而增加了隨糞便排出的膽汁酸及脂質(zhì)[16]。除了白茶，膽暢心寬茶配方內(nèi)的幾味中藥（如蒲公英、代代花、葛根等）均可通過激活A(yù)MPK（AMP依賴蛋白激酶）通路，下調(diào)Srebp-1C（膽固醇應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1c）而降低體內(nèi)甘油三酯及低密度脂蛋白的生成[17]，這與本研究發(fā)現(xiàn)的小鼠體重下降趨勢(shì)相符。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膽暢心寬茶對(duì)于膽固醇性結(jié)石具有一定預(yù)防作用，但受限于實(shí)驗(yàn)條件并未對(duì)背后更進(jìn)一步的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探究，另實(shí)驗(yàn)對(duì)象膽暢心寬茶為沖泡飲用，小鼠個(gè)體攝入量并不完全一致。后續(xù)如有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的條件可將其萃取制成粉劑，定量給予小鼠。

總體而言，膽暢心寬茶能夠減少飲食誘導(dǎo)的膽固醇結(jié)石形成，其機(jī)制可能主要是通過減少膽汁中疏水性膽汁酸，增加親水性膽汁酸如b-鼠膽酸的比例，增加膽固醇在膽汁中的溶解度，從而減少膽固醇的析出。

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