乙型肝炎病毒相關(guān)慢加急性肝衰竭患者的病毒S 基因準(zhǔn)種變異特征分析

李任 余艷芬 李春林 黎運(yùn) 邱曉穎 李湖 高州市人民醫(yī)院感染內(nèi)科，廣東茂名5500； 東莞市東城醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞53000

肝衰竭是臨床常見的危急重癥， 進(jìn)展迅速，預(yù)后較差。 在我國引起肝衰竭的首要病因是HBV，HBV 相關(guān)的慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）約占肝衰竭患者總數(shù)的70%[1]。 HBV-ACLF 的致病機(jī)制比較復(fù)雜， 有研究顯示HBV S 基因變異與HBV-ACLF產(chǎn)生相關(guān)，尤其是S 基因主要親水區(qū)（MHR）相關(guān)變異，但以上研究均基于HBV S 基因的直接測序或逃逸相關(guān)變異分析上，涉及HBV S 基因準(zhǔn)種角度報(bào)道較少[2-4]。 準(zhǔn)種變異能更為真實(shí)地反映在特定時(shí)刻內(nèi)宿主和病毒間的相互適應(yīng)和平衡， 以及感染進(jìn)化過程。本研究對(duì)HBV-ACLF 患者S 基因進(jìn)行準(zhǔn)種擴(kuò)增，并以慢性乙型肝炎（CHB）患者為對(duì)照，研究S 基因準(zhǔn)種變異特征，為探討HBV-ACLF 發(fā)病機(jī)制提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2016年1 月至2018年10 月廣東省高州市人民醫(yī)院收治的HBV-ACLF 患者資料，選取同期收治的CHB 患者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合參考文獻(xiàn)[5-6]中HBV-ACLF 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）書面簽署知情同意書。 排除標(biāo)準(zhǔn)：已行抗病毒治療；肝硬化、肝癌等終末性肝??； 合并非HBV 等病毒感染；非HBV 導(dǎo)致的肝衰竭；合并嚴(yán)重的心、腦、腎等器質(zhì)性病變者。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意（倫理審批號(hào)：20160109）。

二、研究方法

1.HBV S 基因PCR 擴(kuò)增與克隆

采集2 組患者抗病毒治療前血液，離心后取上清液，采用DNA 提取試劑盒（美國Invitrogen 公司）從血清中提取HBV DNA， 采用巢式PCR 法擴(kuò)增HBV S 基因。 第一輪：采用50 μL 體系，取0.5 μL HBV DNA 純化產(chǎn)物作為模板，PCR 第一輪反應(yīng)：上游引物5'-GCCTCATTTTGYGGGTCACCATATTC-3'；下游引物5'-AATTCGTTGACANACTTTCCAATCAAT-3'。 擴(kuò)增條件：95℃變性10 s，退火55 ℃15 s，延伸72 ℃90 s（循環(huán)35 次），延伸72 ℃5 min。 第二輪：采用100 μL 體系，取第一輪產(chǎn)物1 μL，PCR 第二輪反應(yīng)：上游引物5'-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC AAGA-3'；下游引物5'-AATTCGTTGACANACTTTC CAATCAAT-3'，擴(kuò)增條件：95 ℃變性10 s，退火55 ℃10 s，延伸72 ℃90 s（循環(huán)35 次），延伸72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 采用瓊脂糖膠回收試劑盒（日本TaKaRa 公司）回收純化S 基因PCR 產(chǎn)物。 PCR 膠回收產(chǎn)物連接到PMD-19T 載體（日本TaKaRa 公司），轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細(xì)胞（日本TaKaRa 公司），抗氨芐陽性的培養(yǎng)皿培養(yǎng)，每個(gè)樣本隨機(jī)挑選50 個(gè)插有目的基因片段的克隆。 廣州永諾生物科技公司進(jìn)行菌液測序。

2.HBV S 基因準(zhǔn)種分析

采用Vector NTI 軟件與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析并確定基因型。 參考株序列號(hào)：B1D00329、B2AF121249、B3M54923、B4AY033072、B5AB219429、C1AY057947、C2AY217378、C3X75665、C4AB048705、C5AB241111。采用準(zhǔn)種復(fù)雜度和變異度來反映準(zhǔn)種進(jìn)化的異質(zhì)性。 準(zhǔn)種復(fù)雜度采用信息熵指數(shù)（Sn）反映，包含核苷酸、氨基酸水平，衡量準(zhǔn)種的有序程度， 系統(tǒng)的熵值隨系統(tǒng)混亂程度而增加， 參照Shannon 法計(jì)算信息熵，設(shè)計(jì)編程語言包計(jì)算。 準(zhǔn)種變異度用平均遺傳距離（d*）、非同義替換率（dN）和同義替換率（dS）來反映，其中d*分別包含有核苷酸、氨基酸水平，采用MEGA6.0 計(jì)算[7]。

3.HBV 血清標(biāo)志物、肝功能檢測、凝血功能

血清標(biāo)志物采用電發(fā)光法檢測， 檢測儀器為E601，依據(jù)羅氏Ⅱ代試劑盒說明書檢測。 肝功能采用日立7060 型全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑進(jìn)行檢測。凝血功能使用美國ACLTOP 全自動(dòng)血凝儀檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料以K-S 法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用x±s描述，組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用M（Q25，Q75）描述， 組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。定性資料采用例數(shù)和率描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、基本情況

將成功擴(kuò)增S 基因的抗病毒治療前患者99 例納入研究，其中HBV-ACLF 組56例，CHB組43例。兩組患者性別、年齡、HBV 基因型、HBeAg 狀態(tài)、ALT 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。 HBV-ACLF組的TBil 中位數(shù)為219.7 μmol/L， 高于CHB組；凝血酶活動(dòng)度比值 （PTA） 的中位數(shù)為35.0%， 低于CHB 組；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=8.969 和7.473，P均＜0.05)。 詳見表1。

表1 HBV-ACLF 患者與CHB 患者基本資料比較

二、兩組準(zhǔn)種異質(zhì)性相關(guān)指標(biāo)比較

HBV-ACLF 組的核苷酸、氨基酸水平準(zhǔn)種Sn 分別為（0.716±0.181）nt 和（0.597±0.218）AA 明顯高于CHB 組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=2.579 和2.546，P＜0.05）。HBV-ACLF 組的核苷酸、氨基酸水平d*分別為（6.538±3.645）nt 和（7.295±3.336）AA，與CHB 組相比， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=1.059 和1.194，P均＞0.05）。 HBV-ACLF 組 的dS 和dN 分 別 為8.259±2.607 和7.103±3.081，均高于CHB 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.232、5.297，P＜0.01）。 詳見圖1。

三、 兩組S 基因MHR 區(qū)的準(zhǔn)種異質(zhì)性相關(guān)指標(biāo)比較

HBV-ACLF 組S 基因MHR 區(qū)的核苷酸、 氨基酸的Sn 水平 [（0.756±0.184） nt 和 （0.613±0.229）AA]明顯高于CHB 組[（0.598±0.284） nt 和（0.472±0.165） AA]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.332 和5.020，P＜0.01）。 HBV-ACLF 組的核苷酸、 氨基酸的d*[（7.137±3.074） nt 和 （8.280±3.194） AA]明顯高于CHB 組[（5.253±3.237） nt 和（5.963±3.172） AA]，差異 有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=3.599 和5.772，P＜0.01）；dS（9.091±2.720）、dN （7.429±2.860） 也高于CHB 組（5.927±3.035 和5.420±3.272）， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.093 和3.857，P＜0.01）。 詳見圖2。

討 論

ACLF 是HBV 感染者的高危并發(fā)癥，以嚴(yán)重的肝細(xì)胞損害為主，死亡率較高[6]。HBV 引起的肝衰竭具體致病機(jī)制尚無統(tǒng)一的結(jié)論， 目前有關(guān)HBVACLF 的HBV 變異的報(bào)道多集中在前C 區(qū)[8-9]。有研究顯示，I108（M/F）、G285A 氨基酸變異和A158V 核苷酸變異是HBV-ACLF 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但該研究只限于直接測序結(jié)果， 未涉及S 基因準(zhǔn)種研究[2,4]。來自國內(nèi)的研究結(jié)果顯示，HBV-ACLF 與某種特定基因位點(diǎn)突變無關(guān)，而與序列整體的免疫逃逸突變和S 區(qū)的多種突變聚合相關(guān)[10]。

圖1 HBV-ACLF 患者與CHB 患者S 基因準(zhǔn)種異質(zhì)性指標(biāo)的比較

圖2 HBV-ACLF 患者與CHB 患者S 基因MHR 區(qū)準(zhǔn)種異質(zhì)性指標(biāo)的比較

HBV 準(zhǔn)種是由于HBV 復(fù)制過程中產(chǎn)生的大量錯(cuò)配但不構(gòu)成基因型變異的種群現(xiàn)象[11]。 準(zhǔn)種作為一種變量反應(yīng)了在某一特定的時(shí)刻宿主與病毒之間的關(guān)系，能夠客觀地反映宿主在感染病毒后體內(nèi)所產(chǎn)生子代的異質(zhì)性。 準(zhǔn)種異質(zhì)性是反映準(zhǔn)種進(jìn)化指標(biāo)，包括準(zhǔn)種復(fù)雜度和變異度兩類，準(zhǔn)種復(fù)雜度采用Sn 反映，變異度采用d*、dS、dN 反映[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV-ACLF 組HBV S 基因準(zhǔn)種異質(zhì)性指標(biāo)（核苷酸水平的Sn、dS、dN） 較CHB 組偏高， 表明HBV-ACLF 患者在免疫壓力作用下，更易發(fā)生S 基因變異， 進(jìn)而對(duì)S 基因MHR 區(qū)進(jìn)行比較， 發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF 組的所有準(zhǔn)種異質(zhì)性指標(biāo)均明顯高于CHB 組。研究報(bào)道，S 基因MHR 區(qū)包含了抗-HBs 主要的結(jié)合區(qū)域和N-糖基化變異位點(diǎn)， 抗-HBs 特異性識(shí)別能力明顯下降，清除HBV 能力下降，導(dǎo)致持續(xù)免疫應(yīng)答，炎癥過度活化而致肝衰竭的發(fā)生[13]?；诒狙芯拷Y(jié)果， 推測S 基因的準(zhǔn)種異質(zhì)性明顯增高，尤其是MHR 區(qū)，與HBV-ACLF 產(chǎn)生相關(guān)。

通過基因克隆測序方法， 本研究發(fā)現(xiàn)HBVACLF 患者S 基因有較高的準(zhǔn)種異質(zhì)性， 尤其是S基因MHR 區(qū)， 提示S 基因變異可能與HBV-ACLF的發(fā)生有關(guān)，具體作用機(jī)制有待深入研究。 本研究的不足之處是缺乏動(dòng)態(tài)的變異觀察，樣本量稍顯不足，且基于直接一代測序，有待加大樣本量和采用高通量測序研究支持結(jié)論。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突