高危型HPV持續(xù)感染者宮頸局部調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)

林一禾 朱淑嬪 陳游沓

浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(325000)

人乳頭瘤病毒(HPV)易感染女性宮頸黏膜復(fù)層鱗狀上皮。多數(shù)生育期女性會(huì)出現(xiàn)一過性宮頸HPV感染，HPV持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)生是多種因素相互作用結(jié)果[2]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)是一群發(fā)揮免疫抑制功能的獨(dú)特輔助性T淋巴細(xì)胞亞群，可以調(diào)控腫瘤免疫應(yīng)答的整個(gè)階段[3]。本研究分析HR-HPV持續(xù)感染患者宮頸Treg的表達(dá)，探討Treg與宮頸高級(jí)病變相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2018年5月—2020年10月本院婦科收治的高危型HPV陽性但無需特殊治療者476例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～50歲；②行陰道鏡下宮頸組織活檢，病理學(xué)診斷≤低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變(LSIL)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期或哺乳期；②1個(gè)月內(nèi)應(yīng)用陰道灌洗或陰道用藥治療；③既往進(jìn)行過宮頸相關(guān)治療；④患有免疫系統(tǒng)疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；⑤除宮頸癌以外其他器官惡性腫瘤。參照《中國(guó)宮頸癌篩查及異常管理相關(guān)問題專家共識(shí)》中的診治流程[4]，宮頸活檢組織病理學(xué)診斷≤LSIL的患者無需治療但在12個(gè)月時(shí)需再次行HPV-DNA檢測(cè)。根據(jù)隨訪結(jié)果將研究對(duì)象分為HPV持續(xù)感染組(178例)與HPV轉(zhuǎn)陰組(298例)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批。參與對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 宮頸局部調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞檢查

一次性陰道窺器充分暴露宮頸，專用刷頭于宮頸管順時(shí)針或逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈，將刷頭置于液基細(xì)胞學(xué)保存液中，常規(guī)處理后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單細(xì)胞懸液中Treg。將細(xì)胞濃度調(diào)整至(1～2)×107個(gè)/ml，取100μl，加入鼠抗人單克隆抗體，室溫避光20min，加冷固定破膜劑，4℃避光孵育30 min，細(xì)胞染色，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比為Treg百分比。

1.3 HPV-DNA檢測(cè)

使用一次性陰道窺器充分暴露宮頸，以HPV專用細(xì)胞刷于宮頸鱗柱狀交界處取材(取材需停留10s)，取材后的細(xì)胞刷置于保存液中。HR-HPV由本院檢驗(yàn)科醫(yī)師進(jìn)行檢測(cè)，采用雜交捕獲2代(HC-Ⅱ)方法，檢測(cè)13種高危型HPV(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Treg表達(dá)情況

HPV持續(xù)感染組年齡(32.7±10.1歲)與HPV轉(zhuǎn)陰組(33.5±12.9歲)無差異(P>0.05)，Treg(8.2±2.0)%高于HPV轉(zhuǎn)陰組(6.1±3.8)%(t=8.057，P<0.001)。

2.2 HPV持續(xù)感染組臨床指標(biāo)與Treg

在HPV持續(xù)感染組178例中，年齡≥35歲、多重HPV感染、宮頸活檢為L(zhǎng)SIL患者Treg值高于年齡<35歲、單一HPV感染、宮頸活檢為慢性炎癥患者(P<0.05)，體質(zhì)指數(shù)(BMI)≥24kg/m2與<24kg/m2者Treg值未見差異(P>0.05)。見表1。

表1 HPV持續(xù)感染組臨床指標(biāo)與Treg比較

2.3 HPV持續(xù)感染的高危因素

以HPV持續(xù)感染為因變量，以年齡、BMI、HPV感染類型、Treg(以所有研究對(duì)象的均值為截?cái)嘀颠M(jìn)行賦值)為自變量行l(wèi)ogstic回歸分析。結(jié)果顯示，年齡≥35歲、多重HPV感染、Treg≥7.8%為HPV持續(xù)感染的獨(dú)立高危因素(P<0.05)(表2)。

表2 HPV持續(xù)感染的高危因素分析

2.4 Treg對(duì)HPV持續(xù)感染的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，Treg對(duì)HPV持續(xù)感染具有預(yù)測(cè)效能(P<0.001)，AUC為0.834(95%CI：0.754～0.914)，特異性為69.1%，靈敏度為73.4%，最佳截?cái)嘀禐?.4%。

3 討論

HPV是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，黏膜型HPV感染是宮頸癌的高危因素。70%～90%免疫正常的女性在感染HPV后12～30個(gè)月后可自行清除，僅有小部分患者持續(xù)感染而引發(fā)宮頸病變[5]。有研究發(fā)現(xiàn)宿主的免疫狀態(tài)和HPV感染引起的免疫逃逸是持續(xù)性HPV感染導(dǎo)致宮頸細(xì)胞癌變的主要原因[6]。

機(jī)體免疫環(huán)境復(fù)雜多樣，HPV、免疫細(xì)胞與局部微環(huán)境間均存在相互制約、相互調(diào)節(jié)作用和影響[7]。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，Treg細(xì)胞是T細(xì)胞中的一種類型，是CD4+CD25+FOXP3+的T細(xì)胞，通過多種機(jī)制抑制機(jī)體的免疫功能，還可抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤免疫耐受[8]。有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)多種感染性或自身免疫性疾病均與Treg細(xì)胞引起的免疫逃逸有關(guān)。

HPV感染可以導(dǎo)致T細(xì)胞活化增殖，Treg細(xì)胞的上調(diào)抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，使HPV病毒躲過了免疫防護(hù)，導(dǎo)致持續(xù)感染[11]。有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者外周血Treg細(xì)胞異常升高，且表達(dá)量與宮頸癌分期和腫瘤大小有關(guān)[12]。目前，多數(shù)研究?jī)H分析血液中Treg細(xì)胞的異常改變，然而在疾病早期，病變局部免疫抑制出現(xiàn)在機(jī)體全身免疫功能改變之前。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，與HPV病毒載量相比，宮頸局部Treg細(xì)胞與宮頸病變的關(guān)系更加密切。

本研究發(fā)現(xiàn)HPV持續(xù)感染者的宮頸Treg細(xì)胞表達(dá)高于一過性感染者，且持續(xù)感染者的Treg細(xì)胞表達(dá)水平較集中，說明HPV持續(xù)感染者宮頸局部免疫抑制明顯。比較發(fā)現(xiàn)，在HPV持續(xù)感染者中年齡≥35歲、多重HPV感染、宮頸活檢為L(zhǎng)SIL患者Treg高于年齡<35歲、單一HPV感染、宮頸活檢為慢性炎癥患者，推測(cè)年齡、HPV感染種類及宮頸病變與Treg細(xì)胞存在相互交叉關(guān)系。矯正了年齡、BMI、HPV感染類型后發(fā)現(xiàn)，宮頸Treg細(xì)胞比例升高是HPV持續(xù)感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，相對(duì)于Treg細(xì)胞比例<7.8%者來說，≥7.8%者HPV持續(xù)感染風(fēng)險(xiǎn)增加2.306倍。此外，宮頸Treg細(xì)胞比例對(duì)HPV持續(xù)感染還具有預(yù)測(cè)效能，AUC為0.834，預(yù)測(cè)效能良好，當(dāng)宮頸Treg細(xì)胞>8.4%時(shí)預(yù)測(cè)HPV持續(xù)感染的靈敏度為73.4%，特異性為69.1%。

Treg細(xì)胞負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的特性可能導(dǎo)致HPV持續(xù)感染，而這種持續(xù)感染無疑增加了宮頸癌前病變或?qū)m頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。在臨床工作中，針對(duì)HPV感染的患者應(yīng)密切關(guān)注宮頸局部免疫抑制的微環(huán)境，對(duì)HPV的轉(zhuǎn)歸給予初步預(yù)判，有利于個(gè)性化治療隨訪方案的制定，也有助于HPV陽性患者的管理。