DAPK-1與p62/SQSTM1在早發(fā)型重度子癇前期患者胎盤組織中表達及臨床意義

周嬌嬌 薛秀珍

河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院(洛陽，471003)

子癇前期(PE)屬于一種妊娠期高血壓疾病，臨床主要表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿及全身器官功能損害，可引起胎兒宮內(nèi)缺氧和生長受限，是導致孕婦和胎兒死亡的主要原因，世界范圍內(nèi)發(fā)病率為3%～5%[1-2]。根據(jù)癥狀出現(xiàn)時孕周，以孕周34周為界限分為早發(fā)型PE、晚發(fā)型PE。PE是一種妊娠特異性疾病，發(fā)病機制及病因均不清楚，目前研究認為，炎癥和氧化應(yīng)激是胎盤自噬改變的潛在刺激因素，會引起胎盤功能障礙和妊娠病理。DAPK-1和P62/SQSTM1均屬于自噬調(diào)節(jié)因子，其在PE以自噬的形式發(fā)揮著特殊的影響，對生殖功能具有重要的調(diào)控作用。DAPK-1屬于細胞死亡和自噬的調(diào)節(jié)因子[3]，是胎盤組織中廣泛存在的一種分子。在線生物全球定位系統(tǒng)(Bio GPS)顯示，DAPK-1在胎盤中的表達水平是其他任何人類細胞或組織的3.5倍。P62/SQSTM1是一種自噬降解的底物，在PE胎盤活檢樣本的絨毛外滋養(yǎng)層細胞(EVTs)中積累，在體內(nèi)表現(xiàn)為自噬受損[4]，因此自噬狀態(tài)在PE胎盤中出現(xiàn)改變，并且越來越多的研究表明自噬參與妊娠。本研究通過檢測PE胎盤組織中DAPK-1、P62/SQSTM1的表達情況及兩者相關(guān)性研究，探討早發(fā)型重度PE的病理生理機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年12月—2015年10月本院病理科66例PE和30例正常孕婦胎盤組織石蠟標本，其中早發(fā)重度PE 26例，晚發(fā)重度PE 40例，排除：①多胎妊娠、羊水異常、胎兒畸形、胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)窘迫、發(fā)育遲緩患者；②先天性疾病、其他原發(fā)疾病及心血管疾病等合并癥及并發(fā)癥；③合并其他產(chǎn)科并發(fā)癥及其他內(nèi)科合并癥者；④孕期無急、慢性感染性疾病，無煙酒等不良嗜好。診斷標準根據(jù)《婦產(chǎn)科學》第9版標準。本研究通過本院倫理委員會審查，且所有參與者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1SABC法染色(試劑盒均為博士德產(chǎn)品)石蠟標本4μm切片。兔抗人DAPK-1多克隆抗體、兔抗人p62/SQSTM1多克隆抗體。經(jīng)過脫蠟、水化、高壓熱修復；3%的H2O2去離子水室溫孵育10min，PBS沖洗4次(5min/次)；加入5%山羊血清，37℃孵育30min，甩干，直接滴加兔抗人DAPK-1多克隆抗體、兔抗人p62/SQSTM1多克隆抗體，4℃過夜；放置室溫用PBS沖洗4次(5min/次)；滴加生物素標記山羊抗兔IgG,37℃孵育30min，PBS沖洗4次(5min/次)；滴加SABC，37℃孵育30min，PBS沖洗4次(5min/次)；室溫下進行顯微鏡下顯色劑著色10min，蒸餾水充分洗滌后以終止反應(yīng)，再依次以通過蘇木素復染40s，分化液2s，藍化液2min，再蒸餾水沖洗3min后，通過梯度乙醇脫水和二甲苯的透明化，中性樹膠固定封片，最后在顯微鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃(褐)色視為陽性染色。

1.2.2結(jié)果判定任意選取5個高倍鏡視野，陽性細胞占比<25%，1分；≥25%～<50%，2分；≥50%～<75%，3分；≥75%，4分。染色強度：無著色,0分;淺黃色,2分;棕黃色,3分;棕褐色,4分。陽性細胞占比與染色強度之和進行評估：0～1分，陰性(-)；2～3分，弱陽性(+)；4～5分，中度陽性(++)；>5分，強陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

早發(fā)重度PE患者年齡(30.9±5.6)歲，孕周(37.5±1.6)周；<34孕周正常孕婦10例作為其對照組，年齡(27.6±4.0)歲，孕周(38.6±1.8)周；兩組差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。晚發(fā)型發(fā)重度PE患者年齡(27.5±6.0)歲，孕周(37.5±1.6)周；>34孕周正常孕婦20例為對其照組，年齡(28.4±4.4)歲，孕周(38.6±1.8)周。兩組差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.2 DAPK-1、p62/SQSTM1的表達情況

SABC法檢測顯示DAPK-1陽性顆粒為棕褐色，主要表達于絨毛滋養(yǎng)細胞的胞漿；p62/SQSTM1陽性顆粒為棕褐色，表達在絨毛滋養(yǎng)細胞的胞漿。DAPK-1在早發(fā)型重度PE組的陽性表達較對照組和晚發(fā)型重度PE組均高(χ2=26.816，P<0.05；χ2=11.510，P<0.05)；DAPK-1在晚發(fā)型重度PE組的陽性表達高于對照組(χ2=6.076，P<0.05)。p62/SQSTM1 在早發(fā)型重度PE組的陽性表達低于對照組和晚發(fā)型重度PE組(χ2=18.379，P<0.05；χ2=5.442，P<0.05)；晚發(fā)型重度PE陽性表達低于對照組(χ2=6.076，P<0.05)。見圖1(2252頁)、表1。

表1 各組胎盤組織中DAPK-1、p62/SQSTM1的陽性表達比較[例(%)]

2.3 胎盤組織中DAPK-1與p62/SQSTM1相關(guān)性分析

DAPK-1和p62/SQSTM1在PE胎盤組織中的表達水平呈負相關(guān)(r=-0.505，P<0.05)。

3 討論

PE是一種多因素、多機制及多通路致病的疾病，目前研究認為，EVTs深入侵犯子宮螺旋動脈，破壞肌層和彈力層，取代血管內(nèi)皮細胞，這使螺旋動脈擴張并且引起子宮胎盤血流量增加，因此，如果此階段過程失敗導致子宮胎盤血流減少，并且低氧應(yīng)激會影響胎盤異常形成[5]。關(guān)于早發(fā)EP的病因假說主要是基于EP滋養(yǎng)層浸潤淺，胎盤發(fā)育不良。研究發(fā)現(xiàn)，自噬與妊娠高血壓發(fā)病過程中的滋養(yǎng)細胞功能受損、母胎免疫反應(yīng)失衡、子宮螺旋動脈重鑄不良、血管內(nèi)皮細胞損傷和氧化損傷等有密切關(guān)系[5-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，DAPK-1是一種自噬分子，在暴露于炎癥刺激的妊娠早期胎盤外植體中顯著下調(diào)[7]。DAPK-1 是凋亡的正性調(diào)節(jié)因子，參與多種信號通路，調(diào)節(jié)細胞凋亡、自噬、細胞黏附和遷移。女性妊娠時存在胎盤組織滋養(yǎng)細胞凋亡過度 , 影響滋養(yǎng)細胞侵入、子宮螺旋動脈重鑄不足，導致“胎盤淺著床”，使胎盤血液灌注量減少 , 導致 PE的發(fā)生。據(jù)已知相關(guān)類似蛋白的研究得知，DAPK-1可能主要表達在合體滋養(yǎng)細胞胞質(zhì)中，而低氧胎盤組織中的表達水平高于常氧胎盤組織[8]。自噬過度激活時，胎盤滋養(yǎng)細胞釋放的部分物質(zhì)可誘導母體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而使其可釋放一些炎性介質(zhì)(如TNF-α)可與DAPK-1共同促進細胞凋亡、自噬和程序性壞死[9]。本實驗采用免疫組化SABC法檢測DAPK-1在正常、早發(fā)型重度PE、晚發(fā)型重度PE胎盤中的表達，結(jié)果顯示DAPK-1在3組胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞層中均表達，但DAPK-1的表達隨著PE疾病的嚴重程度而增加，與既往研究結(jié)果，DAPK-1的mRNA蛋白表達在EP的妊娠胎盤中升高，提示致病因子的來源可能為胎盤相符合[10]。DAPK-1的表達增高限制滋養(yǎng)細胞凋亡、滋養(yǎng)細胞浸潤等致使胎盤淺著床等可能是引起早發(fā)型重度PE的原因。

P62是一種在人類和動物細胞中的應(yīng)力誘導的細胞蛋白，是氨基酸感應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的信號中樞[11]。p62作為泛素化底物降解的選擇性自噬受體，是mTORC1通路的積極調(diào)節(jié)因子，屬于細胞自噬和mTORC1通路，是細胞信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)，可控制細胞生長和增殖，加速對環(huán)境線索的反應(yīng)[12-13]。自噬是p62降解的原因，因此當自噬異常損傷導致p62大量的積累，進而形成p62陽性聚集結(jié)構(gòu)和泛素[14]。在早發(fā)型子癇患者胎盤中，與正常妊娠胎盤相比，高血壓患者胎盤中的自噬激活蛋白LC3-II增加，p62減少[15]。為探討了解引起早發(fā)型重度PE的發(fā)病機制，本研究采用免疫組化法檢測p62/SQSTM1在正常組、晚發(fā)重度PE組、早發(fā)重度PE組胎盤中的表達情況，結(jié)果顯示，p62/SQSTM1在正常組胎盤中表達最強(P<0.05)，這同潘耀平等[16]研究結(jié)果一致，提示p62/SQSTM1可能參與早發(fā)型重度PE的病理過程，且胎盤中p62/SQSTM1的表達水平與PE的疾病嚴重程度密切相關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示：p62/SQSTM1與DAPK-1在PE胎盤組織的表達水平呈顯著負相關(guān)聯(lián)，表明其在PE的發(fā)展中起協(xié)同作用，共同參與早發(fā)型重度PE的發(fā)生與發(fā)展過程。自噬是p62降解的原因，因此當自噬異常損傷會導致p62大量的積累，進而形成p62陽性聚集結(jié)構(gòu)和泛素[17]；促炎細胞因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)能夠影響自噬基因的編導譜，自噬的PCR 陣列分別在胎盤外植體中響應(yīng)IL-6和TNF-α，顯著下調(diào)DAPK-1的水平[18]。當滋養(yǎng)細胞中DAPK1 mRNA和蛋白減少時，自噬激活蛋白LC3B-I和-II增加，進而使自噬相關(guān)蛋白p62減少。當存在胎盤組織滋養(yǎng)細胞凋亡過度時, 會影響滋養(yǎng)細胞侵入、子宮螺旋小動脈重鑄不足，導致“胎盤淺著床”，使胎盤血液灌注量減少 ,導致子宮螺旋小動脈血管發(fā)生血管重鑄不良，可能會進一步致胎盤缺氧。胎盤缺氧可致使血管內(nèi)皮細胞損傷，炎癥介質(zhì)的釋放以及抗凝物質(zhì)的聚集，引起的螺旋動脈粥樣硬化，血管內(nèi)微血栓的形成，進一步加重、促進炎癥反應(yīng)，加重細胞內(nèi)皮損傷，導致EP的發(fā)生與疾病的進展。DAPK1是一種凋亡與自噬的調(diào)節(jié)劑，DAPK-1與P62共同參與PE的疾病進展。DAPK-1表達增多，細胞凋亡機制受到激活，大量破碎的壞死滋養(yǎng)細胞增多，引發(fā)細胞自噬效應(yīng)，可致P62參與的自噬過程激活，自噬體與溶酶體融合，細胞內(nèi)的P62等蛋白質(zhì)或細胞器被降解，釋放的部分物質(zhì)可誘導母體發(fā)生免疫反應(yīng)，可能刺激其靶細胞釋放促炎細胞因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎性細胞因子可與DAPK-1進入母體的血液循環(huán)；以及同降解的破碎的細胞器或蛋白進入母體血液循環(huán)，致使血管內(nèi)皮細胞損傷，誘發(fā)全身炎癥免疫反應(yīng)過度激活現(xiàn)象，全身小動脈的痙攣，從而螺旋動脈的絨毛外滋養(yǎng)細胞的浸潤能力受損和子宮螺旋小動脈重鑄極其不足，使胎盤血液灌注量減少，導致“胎盤淺著床”，引發(fā)PE。

綜上，本研究的結(jié)果表明早發(fā)型重度PE胎盤中DAPK-1表達高、P62表達低，提示早發(fā)型重度PE的疾病嚴重程度更重，可能兩者共同參與了早發(fā)型重度PE的發(fā)生與發(fā)展；此外它們之間呈負相關(guān)聯(lián)系，可能在早發(fā)型重度PE的發(fā)病中起相互作用。