礦質(zhì)離子螯合肽自組裝遞送體系研究進(jìn)展

尹樂斌，廖聰，劉丹，楊愛蓮，劉椏麗，何平，李樂樂

1(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽，422000)2(豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽，422000)

蛋白質(zhì)與多肽由可修飾的生物分子構(gòu)成，能與其他結(jié)構(gòu)單元相互自組裝成為超分子結(jié)構(gòu)，這種物理化學(xué)現(xiàn)象可通過配位鍵、離子鍵、親水作用、疏水作用、靜電作用、π-π堆積等作用實(shí)現(xiàn)[1]。礦質(zhì)離子螯合肽是一類可通過配位鍵與礦質(zhì)離子自發(fā)組織或聚集為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的一類肽[2]，礦質(zhì)離子不僅影響肽的空間結(jié)構(gòu)，還與生物大分子識(shí)別、自組裝、生物功能等特征有密切關(guān)系。

鈣、鐵、鋅、硒、銅、鉻等礦質(zhì)元素對(duì)人體生長、發(fā)育、繁殖等必不可少，密切關(guān)系著機(jī)體健康。鈣是人體必需元素，占體重1.5%～2.0%，對(duì)骨代謝、神經(jīng)傳遞、肌肉收縮和凝血等功能至關(guān)重要[3]；鉻離子可協(xié)同葡萄糖耐受因子和增強(qiáng)胰島素作用從而影響糖類、蛋白質(zhì)、脂類核酸代謝[4]；鐵離子是實(shí)現(xiàn)和維持血紅蛋白適當(dāng)水平的重要底物[5]；鋅是大量酶的催化組分，在許多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子及激素中有生物學(xué)及構(gòu)效作用[6]；硒有抗癌、抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)免疫和預(yù)防心血管疾病等方面的潛能，被譽(yù)為“生命的火種”[7]。傳統(tǒng)的無機(jī)礦質(zhì)元素補(bǔ)充劑和有機(jī)礦質(zhì)補(bǔ)充劑存在刺激胃腸道、吸收率低等缺點(diǎn)。肽-礦質(zhì)離子螯合物因其特有的組裝模式和吸收機(jī)制，在機(jī)體中可持續(xù)解離，具有易吸收、安全無毒、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[8]。近年研究表明，肽-礦質(zhì)離子螯合物還具有抗氧化、抑菌、降血糖、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)肝臟等功能。因此，肽-礦質(zhì)離子螯合物的應(yīng)用涉及食品保健、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、抗菌添加等方面，具有巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1 多肽-礦質(zhì)離子螯合物的來源及制備與生理活性

1.1 多肽-礦質(zhì)離子螯合物的來源及制備

肽-礦質(zhì)離子螯合物可從3個(gè)方面制備：人工制備的礦質(zhì)離子螯合肽與各類礦質(zhì)離子組裝；天然蛋白質(zhì)酶解獲得的具有螯合能力的多肽與各類礦質(zhì)離子組裝；從動(dòng)植物中直接提取天然肽-礦質(zhì)離子螯合物[2]。富硒水稻就是硒直接與植物中多糖或蛋白質(zhì)結(jié)合用于補(bǔ)充人體硒。BOYLE等[9]將組氨酸殘基引入卷曲螺旋三聚體的疏水核心設(shè)計(jì)出一種肽，會(huì)在加入礦質(zhì)離子時(shí)自組裝。天然蛋白質(zhì)酶解獲得礦質(zhì)離子螯合多肽與各類礦質(zhì)離子配合來制備螯合物更易于獲取與應(yīng)用，且條件溫和、成本低、安全易控制，是發(fā)展的必然趨勢(shì)。有研究報(bào)道了來源于不同動(dòng)植物、乳類、微生物和水產(chǎn)資源中獲得的能與礦質(zhì)離子組裝的多種食物源多肽(表1、表2)。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的水解物具有不同的分子質(zhì)量和不同的生物特性，不同的蛋白酶和作用蛋白的性質(zhì)不同，酶切結(jié)果也不同，料液比、溫度、pH、酶的添加量、時(shí)間等各因素間交互作用也對(duì)水解蛋白的過程有所影響。蛋白質(zhì)可在微生物所產(chǎn)生的多種酶、酸及特定代謝的作用下進(jìn)行水解，因此微生物發(fā)酵法也是制備多肽的基本方法。一些食品加工副產(chǎn)物為微生物生長提供營養(yǎng)來源，可實(shí)現(xiàn)資源高效利用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年研究者傾向于從粗肽研究轉(zhuǎn)向更高純度多肽的研究，CANABADY-ROCHELLE等[10]建立了表面等離子體共振篩選多肽的方法，可定向得到高礦質(zhì)螯合能力的肽。

1.2 礦質(zhì)離子螯合多肽的生理活性

1.2.1 礦質(zhì)元素遞送活性

多肽礦質(zhì)離子螯合物克服了礦質(zhì)離子低濃度時(shí)的低生物利用度和高濃度時(shí)的生物毒性等兩大限制。多肽和氨基酸螯合的礦質(zhì)離子在人體消化道可溶且呈電中性，而礦質(zhì)離子的吸收取決于其螯合配體，與氨基酸相比，小肽的吸收有輸送速度快、載體不易飽和、耗能少等優(yōu)點(diǎn)[11]。肽-礦質(zhì)離子螯合物因其獨(dú)特的組裝形式和吸收機(jī)制，在腸道內(nèi)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，可以避免礦質(zhì)元素沉淀的形成，從而促進(jìn)礦質(zhì)離子的吸收和利用。CAI等[12]通過Caco-2細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),多肽-鈣螯合物與無機(jī)鈣組相比，Caco-2細(xì)胞單層鈣吸收要提高3倍以上。菅景穎等[13]發(fā)現(xiàn)與葡糖酸鈣和CaCO3等補(bǔ)鈣制劑相比，膠原多肽螯合鈣在小鼠質(zhì)量、股骨長度、骨鈣、骨磷以及有機(jī)質(zhì)含量方面均顯著高于其他補(bǔ)鈣劑。

1.2.2 抗氧化活性

表1 不同來源的礦質(zhì)離子螯合肽與礦質(zhì)離子螯合物的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of peptides and mineral ion chelates from different sources

1.2.3 抑菌活性

小分子肽分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)緊密，易于進(jìn)入微生物細(xì)胞，因而能迅速地影響微生物的生長，近年研究表明多肽-礦質(zhì)離子螯合物具有較強(qiáng)的抑菌活性。楊玉蓉等[24]研究表明小分子質(zhì)量(≤5 kDa)桃仁多肽PKP3組分與亞鐵離子螯合后的抑菌活性強(qiáng)于大分子質(zhì)量(≥10 kDa)桃仁多肽亞鐵螯合物，小麥多肽螯合亞鐵和桃仁多肽螯合亞鐵對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度分別為5.0、2.5 mg/mL，對(duì)大腸桿菌最小抑菌濃度均為5.0 mg/mL。蒲傳奮等[25]制備的玉米醇溶蛋白肽鈣通過破壞細(xì)胞膜影響大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的正常生長曲線從而起到抑制作用。KESSLER等[26]則通過實(shí)驗(yàn)證明金屬鋅螯合肽衍生物對(duì)銅綠假單胞菌彈性蛋白酶具有體外抑制作用。

1.2.4 其他生物活性

肽-礦質(zhì)離子螯合物還具有降血糖、保護(hù)肝臟、免疫調(diào)節(jié)等作用。PAULE等[27]發(fā)現(xiàn)多肽GHTD和ISF402與鋅螯合后體內(nèi)降血糖能力強(qiáng)于單獨(dú)使用胰島素，這是由于這類多肽鋅可改變胰島素的六聚體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)胰島素降血糖能力。王秀麗等[28]發(fā)現(xiàn)膠原肽鉻可顯著降低血糖，增加肝糖原的合成及葡糖糖激酶活性。王衛(wèi)國等[29]用納米小肽螯合銅喂養(yǎng)小鼠，測(cè)定小鼠血清中生長因子(IGF-1)、小鼠白介素(IL-2)及血清免疫蛋白IgG、IgM和IgA的含量，得出肽-銅螯合物可提高機(jī)體免疫力的結(jié)論。SUPATCHA等[23]從米糠蛋白中分離出了具有酪氨酸酶抑制活性與銅螯合活性的多肽SSEYYGGEGSSSEQGYYGEG，可在食品和化妝品中發(fā)揮作用。

2 礦質(zhì)離子螯合多肽自組裝模式

較多肽與礦質(zhì)離子的螯合機(jī)理研究針對(duì)于磷酸鹽基團(tuán)結(jié)合模式和羧酸鹽基團(tuán)結(jié)合模式，礦質(zhì)離子螯合肽的羧基、氨基以及側(cè)鏈含具有孤對(duì)電子的氮、氧、硫原子可作為結(jié)合位點(diǎn)，在一定條件下可與礦質(zhì)離子配位結(jié)合形成絡(luò)合物。此外，外界環(huán)境、帶電量及分子質(zhì)量大小都會(huì)影響多肽與礦質(zhì)元素的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)礦質(zhì)螯合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)也相應(yīng)發(fā)生改變[30]，部分不同來源礦質(zhì)離子螯合多肽與礦質(zhì)離子螯合的結(jié)構(gòu)表征分析見表2。

表2 不同來源多肽與礦質(zhì)離子自組裝結(jié)構(gòu)表征Table 2 Characterization of self-assembled structure of peptides and mineral ions from different sources

2.1 磷酸鹽基團(tuán)組裝模式

酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，CPP)和卵黃高磷磷酸骨橋蛋白肽(phosvitin phosphopeptides，PPP)是最早被發(fā)現(xiàn)的促鈣吸收肽。CPP是乳中酪蛋白的酶解產(chǎn)物，活性中心結(jié)構(gòu)為-Ser P-Ser P-Ser P-Glu-Glu-，能與多種礦質(zhì)離子組裝并促進(jìn)其吸收[41]。PPP絲氨酸含量大于30%，磷占比達(dá)8.2%，由卵黃高磷蛋白酶解而得[42]。磷酸化絲氨酸能將鈣離子包裹而形成可溶性復(fù)合物，避免了鈣在人體腸道內(nèi)與植酸鹽形成沉淀[43]。SATO等[44]發(fā)現(xiàn)礦質(zhì)離子螯合肽與鈣離子的結(jié)合與磷酸化絲氨酸基團(tuán)呈正相關(guān)，且酪蛋白分子的磷酸鹽部分對(duì)增強(qiáng)人體小腸吸收鈣離子有必要關(guān)聯(lián)。

2.2 羧酸鹽基團(tuán)組裝模式

多種不含磷酸基團(tuán)的多肽可通過氨基酸殘基中的天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸等羧基組裝礦質(zhì)離子，羧基上的氧原子可通過提供孤對(duì)電子與礦質(zhì)離子形成配位鍵。BAO等[45]研究了大豆蛋白水解物中鈣螯合能力和羧基含量之間的關(guān)系，結(jié)果表明，螯合鈣的量隨著羧基含量的增加而線性增加。LIU等[46]報(bào)道了來自小麥胚芽蛋白水解產(chǎn)物的谷氨酸和天冬氨酸羧基上的氧原子參與了多肽與鈣離子之間的螯合。大豆肽的研究表明，與羧酸基團(tuán)結(jié)合的肽需要較大分子質(zhì)量(3～10 kDa)，這種模式可能需要形成特定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮活性[45]。

2.3 多肽-礦質(zhì)離子螯合物空間結(jié)構(gòu)

EF手性結(jié)構(gòu)(圖1-a)和C2結(jié)構(gòu)域是常見的由-loop-環(huán)結(jié)構(gòu)所組成多肽結(jié)合空間模式。loop環(huán)中分布含氧側(cè)鏈的氨基酸，通過提供氧原子和氮原子的孤電子對(duì)與礦質(zhì)離子配位形成新化合物，同時(shí)氨基酸側(cè)鏈螺旋旋轉(zhuǎn)改變空間位置，便于內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，獲得更多的識(shí)別位點(diǎn)[43]。WANG等[47]設(shè)計(jì)了3組由不同手性氨基酸組成、互為對(duì)映異構(gòu)體的短兩親肽，超分子納米原纖維的扭曲手性由C末端的親水性Lys頭部的手性決定，而其特征圓二色譜信號(hào)則由疏水性Ile殘基的手性決定。BOYLE等[9]將組氨酸殘基引入到卷曲螺旋三聚體的疏水核中，產(chǎn)生了一種在添加金屬離子后自動(dòng)組裝的HisAD肽，如圖1-c所示，HisAD在與Cu(II)絡(luò)合后折疊形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。C2結(jié)構(gòu)域是在蛋白激酶C的鈣依賴亞型中鑒定出來[48]，如圖1-f，C2-結(jié)構(gòu)域頂端的3個(gè)1oop環(huán)里面分布有天冬氨酸可與鈣離子形成β-三明治結(jié)構(gòu)。也有研究提出鈣螯合物在溶液中的構(gòu)象，其中鈣離子被4個(gè)共面碳原子纏繞在八面體型配合物中[49]，圖1-d為溶液中環(huán)[Glu(YOBzl)-Sar-Gly-(N-己基)Gly]z-鈣絡(luò)合物構(gòu)象的Corey-Padi-Koltun分子模型。

WANG等[37]將Asn-Cys-Ser(NCS)和Ser-Met(SM)與Zn2+組裝，發(fā)現(xiàn)在多肽羰基和水的協(xié)調(diào)作用下，多肽的羧基、羥基和巰基與鋅離子形成穩(wěn)固的配位鍵，圖1-b為兩種多肽的某一立體結(jié)構(gòu)。有些多肽在酸性、受冷、受熱等環(huán)境下可聚集，為探究肽聚集對(duì)鈣結(jié)合能力的影響，LIU等[50]分離出了不同分子質(zhì)量且具有不同鈣結(jié)合能力的多肽F1和F2，分析了去羧酸化處理前后多肽與鈣結(jié)合能力和表觀分子重分布的變化。結(jié)果表明，酸性氨基酸的疏水相互作用是肽聚集和鈣結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力，疏水氨基酸如Pro和Phe與鈣結(jié)合氨基酸如Glu和Asp分別在肽的兩側(cè)，如圖1-e所示，黃色箭頭指向發(fā)生疏水聚集的區(qū)域，橙色箭頭指向鈣結(jié)合區(qū)域。當(dāng)2個(gè)分子的肽相遇，疏水氨基酸傾向于聚集和埋藏在分子內(nèi)，將鈣結(jié)合氨基酸聚集在一起，在分子表面形成一個(gè)“鈣結(jié)合區(qū)”而提高鈣結(jié)合力。

圖1 多肽-礦質(zhì)離子自組裝體系空間結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Space structure diagram of peptide-metal ion self-assembly system

2.4 礦質(zhì)離子與肽的多元超分子結(jié)構(gòu)

隨著納米生物技術(shù)的發(fā)展，生物活性分子構(gòu)筑超分子組裝體的概念備受重視。實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合物的可控組裝調(diào)控，對(duì)改進(jìn)材料的效能和安全性意義重大。多糖類物質(zhì)的組裝可以提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，且有利于金屬離子或藥物在胃腸道的緩釋，同時(shí)可為機(jī)體提供活性成分。ZHU等[8]分別以脫鹽鴨蛋清肽、CPP和殼寡糖為材料，成功組裝了多種保護(hù)性鈣緩釋遞送載體，結(jié)果表明，遞送系統(tǒng)可促進(jìn)鈣內(nèi)流，受試動(dòng)物的血清和骨指標(biāo)等顯著增加，且有效促進(jìn)腸道有益菌的增殖，促進(jìn)代謝產(chǎn)物如丁酸含量提高。夏偉榮等[51]以馬脾脫鐵鐵蛋白(horse spleen apoferrin,HSF)及海藻酸鈉(sodium alginate,SA)為載體材料包埋血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽Ala-His-Leu-Leu(AHLL)，利用鐵蛋白在強(qiáng)酸條件下可逆組裝性質(zhì)和多糖的控釋作用，通過HSF和SA靜電吸引形成良好的復(fù)合包埋載體制備均勻分散的HSF-ACE抑制肽及HSF-SA-ACE抑制肽納米復(fù)合體系，提高了AHLL在消化系統(tǒng)中的吸收效果。

3 多肽-礦質(zhì)離子螯合物自組裝遞送體系生物利用度研究進(jìn)展

以往的觀點(diǎn)認(rèn)為，人體吸收的礦質(zhì)離子取決于十二指腸和近端空腸在吸收位點(diǎn)處離子形式的可溶性礦質(zhì)離子量，肽-礦質(zhì)離子螯合物中的礦質(zhì)離子通過競爭形式被吸收。隨著研究的深入，有學(xué)者提出肽-礦質(zhì)離子螯合物以完整的結(jié)構(gòu)進(jìn)人循環(huán)系統(tǒng)的假說，此時(shí)機(jī)體通過肽通道吸收螯合物，可避免與其他礦質(zhì)離子吸收的拮抗競爭，從而提高其生物利用度。鈣遞送體系的主要體內(nèi)活性研究路線如圖2所示[8]：一般研究過程為構(gòu)建礦質(zhì)離子螯合肽的自組裝體系，并研究其結(jié)構(gòu)表征，然后細(xì)胞模型與動(dòng)物模型研究其促礦質(zhì)離子吸收活性。ZHU等[8]在Caco-2細(xì)胞單層模型、Caco-2細(xì)胞群體模型和外翻腸囊模型中發(fā)現(xiàn)脫鹽鴨蛋白肽可增強(qiáng)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，且可通過充當(dāng)鈣離子載體與細(xì)胞膜相互作用以打開特定吸收通道實(shí)現(xiàn)促鈣吸收，且脫鹽鴨蛋白肽可抵抗植酸的不良影響。

上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)可通過增加體內(nèi)肥大軟骨細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)數(shù)量調(diào)節(jié)Wnt/catenin通路。YE等[52]對(duì)牦牛骨膠原衍生肽(GPAGPPGPIGNV，GP-12)體外穩(wěn)定性研究表明，在模擬胃腸消化吸收(Caco-2細(xì)胞單層)實(shí)驗(yàn)后，GP-12消化成更小的肽，然而它們?nèi)钥赏ㄟ^細(xì)胞旁路途徑實(shí)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞單層完整吸收。如圖3所示，GP-12通過激活Wnt /β-catenin途徑與EGFR途徑之間的通路，誘導(dǎo)從G0/G1到S期以及從S到G2/M期的細(xì)胞周期進(jìn)程的改變來完成成骨細(xì)胞增殖和分化。

圖3 Wnt/β-catenin途徑與EGFR途徑參與GP-12的成骨細(xì)胞增殖和分化相互作用模擬模型[52]Fig.3 Proposed model of the cross-talk between Wnt/β-catenin pathway and EGFR pathway involved in osteoblastic proliferation and differentiation by GP-12

4 展望

多肽-礦質(zhì)離子自組裝遞送體系不僅可解決礦質(zhì)元素在人體內(nèi)吸收差和生物活性低的問題，同時(shí)也具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和降血糖等作用，具有很高的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。但目前用于工業(yè)生產(chǎn)的礦質(zhì)離子螯合肽仍只有CPPs和PPPs，其他來源的礦質(zhì)離子螯合肽投入在實(shí)際生產(chǎn)中的少之又少。且目前的研究只處于實(shí)驗(yàn)室階段，存在成本高、產(chǎn)量低、純度不高等制約因素。關(guān)于多肽-礦質(zhì)離子螯合物還存在系統(tǒng)安全性評(píng)估、活性機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系研究不全面的問題，近年來雖有較多細(xì)胞模型與小鼠活體模型為多肽-礦質(zhì)離子螯合物在人體的轉(zhuǎn)運(yùn)與影響奠定了一定基礎(chǔ)，但多肽-礦質(zhì)離子螯合物對(duì)人體是否有同樣的效用還有待進(jìn)一步研究。此外，蛋白質(zhì)或多肽在多元超分子自組裝中有巨大潛力，蛋白質(zhì)和多肽可以在水溶液分散納米膠束中進(jìn)行自組裝，也可以通過靜電和疏水作用負(fù)載活性化合物，如花色苷，姜黃素和β-胡蘿卜素，且這些膠束在模擬胃腸液中具有很好的穩(wěn)定性。將多糖、多酚、黃酮等生理活性物質(zhì)與礦質(zhì)離子螯合肽共建的復(fù)合自組裝遞送體系，構(gòu)建膜、水凝膠、膠束、囊泡和納米顆粒及皮克林乳液等，對(duì)于遞送體系的穩(wěn)定性及擴(kuò)展更多活性具有重要意義，對(duì)促進(jìn)礦質(zhì)離子吸收和調(diào)節(jié)腸道微生物的食品材料以及藥物遞送和其他潛在功能等方面有廣闊前景。隨著對(duì)蛋白質(zhì)及多肽自組裝研究的繼續(xù)深入，蛋白質(zhì)和多肽的自組裝遞送體系的潛在功能也將被持續(xù)開發(fā)，在未來的食品領(lǐng)域中具有更廣闊的應(yīng)用前景。