紅棗多糖超聲波提取、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性評價(jià)

楊燕敏，鄭振佳，高琳，張硯壘，張仁堂

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安, 271018)

紅棗(ZiziphusjujubaMill.)，又名大棗、棗子、中華大棗，有“維生素王”之稱，是鼠李科棗屬植物棗樹的果實(shí)[1]。紅棗是藥食同源品種，富含維生素、多糖、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮和環(huán)磷酸腺苷等營養(yǎng)物質(zhì)，具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血安神、治療脾虛食少與婦人臟躁等病癥的功效[2]。

多糖是紅棗中一種重要的生物活性物質(zhì)，研究表明紅棗多糖具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、保肝[5]和降血脂[6]等多種生物活性。超聲波輔助提取具有提取時(shí)間短、操作簡單、成本低及提取率高等優(yōu)點(diǎn)[7]，廣泛應(yīng)用于植物功能組分的提取中。紅棗多糖的抗氧化活性主要集中于體外抗氧化評價(jià)，體內(nèi)抗氧化評價(jià)研究較少，斑馬魚與人體器官在分子水平、生理結(jié)構(gòu)等方面非常相似[8]，其模型能夠反映活性成分的體內(nèi)抗氧化效果。本實(shí)驗(yàn)以新疆哈密大棗為研究對象，采用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取多糖，并研究了多糖的結(jié)構(gòu)表征、體外以及斑馬魚體內(nèi)抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆哈密大棗，泰安棗批發(fā)市場；皮膚熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚，山東省科學(xué)院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺。

濃硫酸，優(yōu)級純，濟(jì)南試劑總廠；苯酚、石油醚、無水乙醇、葡萄糖，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；2,2′-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，分析純，合肥博美生物科技有限公司；正丁醇，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；單糖標(biāo)準(zhǔn)品(鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)，色譜純，上海源葉生物科技有限公司；甲硝唑、維生素C，分析純，上海生物化工公司；鏈霉蛋白酶、氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，分析純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

754 N紫外可見分光光度計(jì)，上海奧普勒儀器有限公司；UV—2450紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；高效陰離子交換色譜儀、Nicole iS10型紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific科技公司；X51型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Forma 3111型水套式CO2培養(yǎng)箱，美國Forma公司；斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設(shè)備，北京愛生科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅棗多糖的提取

紅棗去核切片→干燥粉碎、過40目篩→超聲提取紅棗多糖→離心取上清液→加入4倍體積無水乙醇醇沉過夜→離心取沉淀定容→苯酚硫酸法測多糖含量

1.3.1.1 單因素試驗(yàn)

以1.0 g棗粉為基準(zhǔn)，固定提取溫度60 ℃，超聲時(shí)間30 min，超聲功率300 W，研究不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL∶g)對紅棗多糖提取率的影響；固定液料比20∶1 (mL∶g)，超聲時(shí)間30 min，超聲功率300 W，研究不同提取溫度40、50、60、70、80 ℃對紅棗多糖提取率的影響；固定液料比20∶1(mL∶g)，提取溫度60 ℃，超聲功率300 W，研究不同超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min對紅棗多糖提取率的影響；固定液料比20∶1 (mL∶g)、提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間30 min，研究不同超聲功率100、200、300、400、500 W對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定超聲功率200 W，確定超聲溫度、液料比以及超聲時(shí)間的3因素3水平。利用Design-Expert 8.0.6 軟件Box-Behnken 法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，以多糖提取率為響應(yīng)值，研究提取紅棗多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)。響應(yīng)面水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.2 紅棗多糖分離純化

將最優(yōu)條件得到的多糖樣品進(jìn)行石油醚脫脂，用石油醚和粗多糖溶液按1∶1體積比充分混勻，用分液漏斗分離，重復(fù)3次脫脂；Sevage法脫蛋白[9]；通過透析去除小分子雜質(zhì)，濃縮后冷凍干燥多糖組分，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 指標(biāo)測定

采用苯酚硫酸法測定紅棗多糖含量[10]，回歸方程為：y=0.011x+ 0.0064，R2=0.9997。采用考馬斯亮藍(lán)法對紅棗多糖蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定[11]，回歸方程為：y=8.1243x+0.0423，R2=0.9911。

1.3.4 單糖組成

在80 ℃下,10 mg多糖用4 mL 2.0 mol/L的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)水解6 h，通過N2沖洗除去溶液中殘留的TFA，然后溶于10 mL超純水中并通過SPE管和0.22 μm 超濾管進(jìn)行澄清。使用PA10 IC色譜柱在30 ℃下以0.20 moL/L NaOH溶液作為流動相,0.25 mL/min的流速分析樣品。

1.3.5 光譜分析

1.3.5.1 紫外光譜分析

將多糖溶液在190～400 nm波段下進(jìn)行掃描，分析掃描圖譜，觀察有無核酸吸收峰(260 nm)和蛋白質(zhì)吸收峰(280 nm)，檢測雜質(zhì)是否去除干凈[12]。

1.3.5.2 紅外光譜分析

取適量干燥的多糖樣品使用傅立葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，使用OMNIC軟件分析結(jié)果[13]。

1.3.6 剛果紅染色

取1 mL 1 mg/mL紅棗多糖溶液、2 mL 60 μmol/L剛果紅溶液及1 mL不同濃度的NaOH溶液，靜置15 min后觀察不同濃度的NaOH溶液中多糖最大吸收波長的遷移情況[14]。

1.3.7 抗氧化

1.3.7.1 體外抗氧化

總還原力的測定，參照LIN等[15]的方法；DPPH自由基清除能力測定，參照許海順等[16]的方法；ABTS陽離子自由基清除能力的測定，參照胡治遠(yuǎn)等[17]的方法。

1.3.7.2 斑馬魚模型的抗氧化作用

發(fā)育24 h的皮膚熒光斑馬魚，使用鏈霉蛋白酶脫去其胚胎外層的卵膜后隨機(jī)分成空白對照組(NC)、5 mmol/L甲硝唑造模組(MC)、陽性對照組(5 mmol/L甲硝唑+100 μg/mL Vc)(PC)、1 μg/mL紅棗多糖組(I)和25 μg/mL紅棗多糖組(II)，在熒光顯微鏡下觀察拍照。使用Imagepro-plus軟件統(tǒng)計(jì)斑馬魚的皮膚熒光點(diǎn)數(shù)量，并利用GraphPad軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評估樣品的抗氧化活性。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

超聲功率對多糖提取率的影響如圖1-a所示，功率100～200 W時(shí)，多糖提取率升高，當(dāng)超聲功率繼續(xù)加大時(shí)，多糖提取率反而下降，由于超聲功率增大有助于細(xì)胞壁的破碎和液固兩相的相互混合，多糖提取率增大，但功率過強(qiáng)時(shí)，超聲波空化作用加大，多糖糖苷鍵可能遭到破壞，影響多糖提取率[18]。因此超聲功率以200 W為宜。超聲溫度對多糖提取率的影響如圖1-b所示，40～50 ℃時(shí)，溫度升高多糖提取率升高。溫度低時(shí)，分子運(yùn)動慢使得多糖無法充分溶出，隨溫度升高，分子運(yùn)動加快，多糖提取率升高。但是溫度升高到50 ℃以上時(shí)，隨溫度升高多糖提取率反而降低，這可能因?yàn)闇囟壬哂绊懚嗵欠€(wěn)定性，多糖糖鏈降解，多糖提取率降低[19]。因此，適宜紅棗多糖提取的溫度為50 ℃。超聲時(shí)間對多糖提取率的影響如圖1-c所示，提取時(shí)間在10～20 min時(shí)，時(shí)間越長提取率越大，20 min時(shí)達(dá)到最大值。繼續(xù)延長提取時(shí)間，多糖提取率反而降低，因?yàn)樘崛∏捌诩?xì)胞不斷破碎，使多糖溶出、得率增大，當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)延長，會導(dǎo)致多糖降解，使多糖得率降低[20]。因此，最適宜的超聲時(shí)間為20 min。液料比對多糖提取率的影響如圖1-d所示，當(dāng)液料比從10∶1 (mL∶g)增加到15∶1 (mL∶g)時(shí)，溶劑較少，不利于多糖擴(kuò)散。隨液料比增大，多糖提取率升高，在液料比15∶1時(shí)達(dá)到最大值。隨后提取率降低，隨著溶劑增加，多糖盡可能游離到溶液中，但溶劑量過大，大量雜質(zhì)也會溶出，擠占多糖空間，導(dǎo)致提取率不升反降[21]。因此，最適宜的液料比為15∶1。

圖1 單因素對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of single factor on the extraction rate of polysaccharides

2.2 提取工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 模型方程建立與顯著性實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以超聲溫度(A)、液料比(B)和超聲時(shí)間(C)為自變量，以紅棗多糖得率(Y)為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，得到的響應(yīng)面分析結(jié)果如表2所示，得到回歸方程Y=3.06-0.11A+0.15B+0.070C+0.027AB-0.14AC+0.068BC-0.40A2-0.29B2-0.17C2。

回歸模型的方差分析結(jié)果如表3所示，模型P為0.000 1，說明該回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.068 2>0.05，R2=0.972 5，表明該模型實(shí)驗(yàn)誤差小，可利用該方程分析及預(yù)測紅棗多糖提取率隨相關(guān)因素變化的波動情況。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

從表3中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，回歸模型二次項(xiàng)中的A、B、A2、B2、C2(P<0.01)達(dá)到極顯著水平，C和AC達(dá)到顯著水平(P<0.05)，AB與BC不顯著(P>0.05)。B液料比對多糖提取率影響最大，其次是A超聲溫度，C超聲時(shí)間對多糖提取率影響最小。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用影響結(jié)果

響應(yīng)面圖以及等高線圖可以直觀地反映兩兩因素間的交互作用。響應(yīng)面圖越陡峭說明2個(gè)自變量間的交互作用對響應(yīng)值影響程度越大，相反，越平緩交互作用影響越不顯著[22]。等高線圖越偏離圓形交互影響越強(qiáng)，反之，越接近圓形交互影響越弱。由圖2 分析得出，AC響應(yīng)面3D圖陡峭，且等高線圖呈明顯的橢圓形，交互作用顯著，AB與BC等高線圖接近圓形，表明交互作用不顯著(P>0.05)，這與方差結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)條件的確定與回歸模型的驗(yàn)證

通過試驗(yàn)分析，超聲輔助提取紅棗多糖最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲功率200 W、超聲溫度48.05 ℃、液料比16.49∶1 (mL∶g)、超聲時(shí)間23.52 min，多糖最優(yōu)得率為3.11%，高于方元等[23]超聲波提取哈密大棗多糖的得率。考慮到實(shí)際操作的方便性，將提取條件調(diào)整為：超聲功率200 W、超聲溫度48 ℃、液料比16∶1(mL∶g)、超聲時(shí)間24 min，此工藝條件下進(jìn)行超聲波輔助法提取紅棗多糖，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，得率為3.09%。實(shí)際測定值與預(yù)測值誤差較小，表明優(yōu)化后的紅棗多糖提取工藝條件準(zhǔn)確可靠。

圖2 各因素交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on polysaccharide yield

2.3 指標(biāo)測定

經(jīng)測定，紅棗多糖總糖含量為(50.98±1.26)%、蛋白質(zhì)含量為(1.26±0.08)%。

2.4 單糖組成

紅棗多糖單糖組成的高效陰離子交換色譜如圖3所示。根據(jù)出峰時(shí)間和峰面積可以推斷紅棗多糖的單糖組成和比例，其單糖組成主要為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖以及半乳糖醛酸，比例為45.90∶19.72∶19.88∶3.03∶10.37∶1.10。

圖3 基于HPAEC-PAD的標(biāo)準(zhǔn)品和紅棗多糖的單糖譜Fig.3 Monosaccharide profiles of jujube polysaccharide based on HPAEC-PAD standards

2.5 光譜分析

2.5.1 紫外光譜分析

由圖4可知，在280 nm波長處有弱吸收峰，表明其含有蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果相符合。

圖4 紅棗多糖的紫外掃描圖譜Fig.4 UV spectrum of jujube polysaccharide

2.5.2 傅里葉紅外變換光譜分析

圖5 紅棗多糖的紅外圖譜Fig.5 FT-IR spectrum of jujube polysaccharide

2.6 剛果紅實(shí)驗(yàn)

由圖6可以看出，隨著NaOH溶液濃度從0增大到0.5 mol/L，紅棗多糖與剛果紅試劑作用產(chǎn)生絡(luò)合物的最大吸收波長呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，最大吸收波長的連續(xù)下降可能是因?yàn)槎嗵窃谒芤褐袨闊o規(guī)卷曲構(gòu)象，且越來越多的氫鍵被堿性溶液破壞[28]，可以判斷該紅棗多糖不具備三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖6 不同NaOH濃度下多糖與剛果紅絡(luò)合物最大吸收波長Fig 6 Maximum absorption wavelength of Congo red and Congo red-polysaccharides at various concentrations of NaOH

2.7 抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.7.1 體外抗氧化能力

由圖7可知，隨紅棗多糖濃度的增大，對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力逐漸升高后趨于穩(wěn)定，呈一定的劑量關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率可達(dá)89%，其IC50為0.365 mg/mL；ABTS陽離子自由基清除率可達(dá)99%，其IC50為0.272 mg/mL。在0～1 mg/mL范圍內(nèi)，總還原能力隨多糖濃度增大而增大，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，其吸光度可達(dá)0.764。

圖7 紅棗多糖的體外抗氧化Fig.7 In vitro antioxidant activity of jujube polysaccharides

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅棗多糖具有一定體外抗氧化能力。

2.7.2 斑馬魚抗氧化模型

從圖8可知，與空白對照組相比，經(jīng)甲硝唑處理的模型組皮膚熒光數(shù)量極顯著降低(P<0.001)，Vc和紅棗多糖能夠有效緩解這種氧化損傷。與甲硝唑組相比，紅棗多糖在1和25 μg/mL下均具有抗氧化活性，尤其25 μg/mL的紅棗多糖皮膚熒光數(shù)量極顯著增加(P<0.001)，是100 μg/mL Vc的1.65倍。結(jié)果表明，紅棗多糖可以減輕甲硝唑?qū)Π唏R魚模型的氧化損傷。

圖8 紅棗多糖對甲硝唑誘導(dǎo)的斑馬魚氧化損傷模型的保護(hù)作用Fig.8 Protective effect of jujube polysaccharides on the zebrafish oxidative damage model induced by metronidazole

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到了超聲輔助提取紅棗多糖工藝參數(shù)，在此條件下紅棗多糖得率為(3.11±0.15)%。光譜分析和剛果紅結(jié)果表明紅棗多糖為α-糖苷鍵的吡喃型糖苷環(huán)骨架，不含三螺旋結(jié)構(gòu)，含少量蛋白質(zhì)。主要的單糖組成成分為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖以及半乳糖醛酸等。體外抗氧化活性評價(jià)與斑馬魚抗氧化損傷模型共同證明了紅棗多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。該研究為紅棗多糖進(jìn)一步分離純化、結(jié)構(gòu)解析、生物活性的研究以及開發(fā)具有潛力的功能性食品提供依據(jù)。