牛類芽孢桿菌BD3526發(fā)酵麥麩抑制變形鏈球菌的特性

馮華峰，韓瑨，王曉花，吳正鈞*

1(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)2(上海商學(xué)院 食品質(zhì)量與安全系，上海，200235)

變形鏈球菌(Streptococcusmutans)是口腔中典型的致齲細(xì)菌，能牢固地黏附在牙齒表面，代謝外源性糖產(chǎn)酸破壞牙釉質(zhì)；又能與口腔中其他細(xì)菌共聚，逐漸形成一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的牙菌斑生物膜，從而導(dǎo)致齲齒的發(fā)生[1-2]。所以，抑制S.mutans的生長(zhǎng)或控制牙菌斑生物膜的形成，是預(yù)防齲齒發(fā)生的有效措施[3-4]。

類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)微生物具有增殖速率高、抗逆能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)要求低的特點(diǎn)，其在生長(zhǎng)代謝過程可產(chǎn)生抗菌肽、功能性小肽、蛋白水解酶以及胞外多糖等多種功能物質(zhì)[5]，因此具有重要的應(yīng)用價(jià)值[6-9]。牛類芽孢桿菌(Paenibacillusbovis)BD3526是近期被發(fā)現(xiàn)的類芽孢桿菌屬的新種，其代謝產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能，也是“下一代益生菌”潛在候選者[10-12]。各種研究表明益生菌可通過抑制致病菌生長(zhǎng)，改善口腔微生物菌群，調(diào)節(jié)口腔免疫力等方式對(duì)各種口腔疾病產(chǎn)生積極的防治效果[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，P.bovisBD3526以麥麩為發(fā)酵介質(zhì)，能合成高活力的凝乳酶[14-15]和Fusaricidin類抗菌肽[16]等功能物質(zhì)。本研究采用類似的發(fā)酵材料，以麥麩為培養(yǎng)基、P.bovisBD3526為發(fā)酵菌株，通過生長(zhǎng)曲線、pH值變化和對(duì)S.mutansATCC35668抑制活性的測(cè)定，再通過酶解處理、熱穩(wěn)定性和pH適用范圍，以及對(duì)口腔中其他益生菌的影響等方面的研究，初步判定P.bovisBD3526所產(chǎn)對(duì)變形鏈球菌抑菌物質(zhì)的類型及抑菌特性，為后續(xù)深入研究與產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：PaenibacillusbovisBD3526、唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)BD3900、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ST-III和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)LC2 W，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；StreptococcusmutansATCC35668，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

脫脂乳(skimmed milk，SKM)培養(yǎng)基，配制質(zhì)量濃度為40 g/L的脫脂乳液體培養(yǎng)基，于118 ℃滅菌15 min，冷卻備用；麥麩培養(yǎng)基，配制質(zhì)量濃度為30 g/L(裝量為60 mL/250 mL三角瓶)，先在電爐上糊化5～10 min，再于121 ℃滅菌20 min，冷卻備用；腦心浸出液肉湯(brain heart infusion，BHI)培養(yǎng)基，英國(guó)OXIOD公司；TYC培養(yǎng)基，上海瑞楚生物科技有限公司;MRS培養(yǎng)基，默克化工技術(shù)(上海)有限公司。

將P.bovisBD3526劃線于TYC固體平板上，30 ℃好氧培養(yǎng)72 h，活化2代后，挑取1～2個(gè)單菌落，接種于質(zhì)量濃度40 g/L脫脂乳粉液體培養(yǎng)基中(裝量為20 mL/100 mL三角瓶)，30 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)20 h，調(diào)整至活菌數(shù)1.0×108～2.0×108CFU/mL，即得P.bovisBD3526發(fā)酵種子液。

過氧化氫酶(來源于牛肝臟)、α-淀粉酶(來源于人類唾液)、胃蛋白酶(來源于豬胃黏膜)、胰蛋白酶(來源于豬胰腺)和鏈霉蛋白酶(來源于灰色鏈霉菌)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；脫脂乳粉，新西蘭恒天然集團(tuán)；麥麩，當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；其他有機(jī)化學(xué)試劑均是分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50型高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；GNP-9270型隔水恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SG-402TX型超凈工作臺(tái)，美國(guó)BAKER公司；PB-100型pH計(jì)，德國(guó)賽多利斯公司；HZQ-X500C大型恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BUGBOX型厭氧培養(yǎng)箱，英國(guó)Ruskinn公司；Millipore-Q超純水儀，美國(guó)密理博公司；RW20.n高速電動(dòng)攪拌機(jī)，德國(guó)IKA公司；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司；3-18K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA離心機(jī)實(shí)驗(yàn)室公司；Micro 17R微量臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；MDF-U73V型醫(yī)用超低溫冰箱，日本松下電子公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 指示菌平板制備

將S.mutansATCC35668從超低溫冰箱中取出，劃線于BHI固體平板上，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h，活化2代后，挑取4～5個(gè)單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中(裝量為5 mL/10 mL)，過夜培養(yǎng)，4 ℃，3 000×g離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)[17]，再制備1.0×106～2.0×106CFU/mL的指示菌平板[18]。根據(jù)上述方法制備唾液鏈球菌BD3900、植物乳桿菌ST-III和干酪乳桿菌LC2 W的指示菌平板上，其中植物乳桿菌ST-III和干酪乳桿菌LC2 W是以MRS為培養(yǎng)基。

1.3.2 抑菌活性測(cè)定

將菌株P(guān).bovisBD3526種子液接入麥麩培養(yǎng)基中，180 r/min搖床中培養(yǎng)，發(fā)酵36 h后收集發(fā)酵液，煮沸10 min，冷卻至室溫，pH調(diào)至5.60，4 ℃，9 000×g離心30 min，收集上清液，經(jīng)無菌過濾后，移取100 μL加入牛津杯中，并放置于指示菌的平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察并用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑(mm)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)以無菌發(fā)酵液(pH調(diào)至5.60)作為空白對(duì)照。

1.3.3 菌株P(guān).bovisBD3526在麥麩培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性

將菌株P(guān).bovisBD3526種子液以3.0%(體積分?jǐn)?shù))接種量，接種于30 g/L麥麩培養(yǎng)基中(裝量為60 mL/250 mL三角瓶)，32 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，于0、3、6、9、12、24和36 h，測(cè)定P.bovisBD3526發(fā)酵體系的pH值、活菌數(shù)以及發(fā)酵上清液對(duì)S.mutanATCC35668的抑菌圈直徑。

1.3.4 酶敏感性測(cè)定

分別用20 mmol/L磷酸緩沖液配制8.0 mg/mL的過氧化氫酶、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶，調(diào)節(jié)至各酶的最適pH值(過氧化氫酶pH為7.0、α-淀粉酶pH為6.9、胃蛋白酶pH為2.0、胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶pH為7.5)。分別將各酶溶液與P.bovisBD3526發(fā)酵上清液混合后(1∶3，體積比)，在37 ℃水浴中(過氧化氫酶溫度為35 ℃)保溫3 h后，在沸水浴中處理15 min，冷卻至室溫，pH調(diào)至5.60，4 ℃，9 000×g離心30 min，無菌過濾后，測(cè)定對(duì)S.mutansATCC35668的抑菌圈直徑。以未經(jīng)酶處理的樣品為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 熱穩(wěn)定性測(cè)定

P.bovisBD3526發(fā)酵上清液分別在50、60、70、80和90 ℃水浴中加熱1 h，在沸水浴中加熱30 min，以及121 ℃溫度下處理15 min，4 ℃，9 000×g離心30 min，無菌過濾后，以未經(jīng)熱處理的樣品為對(duì)照組，測(cè)定抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 pH適用范圍測(cè)定

分別用濃度1.0 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液，調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，4 ℃，9 000×g離心30 min，無菌過濾后，以未處理的發(fā)酵液上清為對(duì)照組，測(cè)定抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prsim 7.00軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，并用SPSS 24.0 的單因素方差分析來統(tǒng)計(jì)分析顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān).bovis BD3526在麥麩培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性

菌株P(guān).bovisBD3526在麥麩培養(yǎng)基中pH值和活菌數(shù)的變化如圖1所示。在6～9 h時(shí)是菌株P(guān).bovisBD3526對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在12 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到峰值1.56×109CFU/mL。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌總數(shù)開始緩慢下降，直至發(fā)酵終點(diǎn)(36 h)的活菌數(shù)為4.58 ×108CFU/mL。前期由于P.bovisBD3526快速生長(zhǎng)，消耗了發(fā)酵體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并積累了不利于菌體生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物使活菌總數(shù)在后期發(fā)生降低。P.bovisBD3526發(fā)酵體系的pH值快速下降階段與菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期基本一致，至發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)pH值為5.20。培養(yǎng)介質(zhì)中碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸，是導(dǎo)致發(fā)酵體系的pH變化的主因。

圖1 菌株P(guān).bovis BD3526在麥麩培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵液pH值變化Fig.1 Variation of pH and viable counts of strain P.bovis BD3526 grown in wheat bran culture

在發(fā)酵過程中P.bovisBD3526發(fā)酵上清液對(duì)S.mutansATCC35668抑菌圈直徑的變化如圖2所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)(>12 h)，發(fā)酵上清液抑菌活性依次增強(qiáng)。在36 h時(shí)發(fā)酵上清液的抑菌活性達(dá)到最大，其抑菌圈直徑為(21.27±0.71)mm，屬于極敏感程度。

圖2 菌株P(guān).bovis BD3526在麥麩培養(yǎng)基中的抑菌活性變化Fig.2 Variation of antibacterial activity of strain P.bovis BD3526 grown in wheat bran culture

這種抑菌效果與發(fā)酵時(shí)間的正相關(guān)性表明P.bovisBD3526抑菌物質(zhì)可能是其次級(jí)代謝產(chǎn)物，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)充裕時(shí)，依然處于持續(xù)積累的狀態(tài)。

2.2 菌株P(guān).bovis BD3526抑菌物質(zhì)對(duì)口腔中不同細(xì)菌的影響

益生菌可通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制口腔病原菌黏附、定植，阻止病原菌生物膜形成，以及調(diào)節(jié)宿主黏膜免疫系統(tǒng)，尤其可以減少唾液中病原菌S.mutants和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)的數(shù)量[19-20]。P.bovisBD3526發(fā)酵上清液凍干粉，在不同濃度下對(duì)S.mutantsATCC35668的抑制效果如表1所示。P.bovisBD3526抑菌物質(zhì)對(duì)植物乳桿菌和干酪乳桿菌無抑菌活性，僅對(duì)鏈球菌屬細(xì)菌有強(qiáng)烈的抑制活性。前期的研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌屬微生物合成的Fusaricidin A對(duì)需氧型革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等)具有顯著的抑菌作用，但對(duì)變形鏈球菌的生長(zhǎng)無影響[21]。本實(shí)驗(yàn)中P.bovisBD3526麥麩發(fā)酵液對(duì)S.mutansATCC35668的特異性抑制結(jié)果，為類芽孢桿菌在防齲、治齲方面的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

表1 P.bovis BD3526發(fā)酵上清液對(duì)不同菌株的抑制效果Table 1 Antibacterial activity of fermentation supernatant of P.bovis BD3526 against different strains

2.3 菌株P(guān).bovis BD3526抑菌物質(zhì)的酶敏感性

由圖3可知，經(jīng)過氧化氫酶處理后的P.bovisBD3526發(fā)酵上清液，其抑菌活性未發(fā)生顯著變化，表明發(fā)酵液中抑菌活性非過氧化氫引起的。

圖3 不同酶處理后P.bovis BD3526發(fā)酵上清液的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of fermentation supernatant of P.bovis BD3526 after being digested by different protease

經(jīng)過α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，發(fā)酵液上清的抑菌活性也未發(fā)生明顯變化，預(yù)示著未來此抑菌物質(zhì)在攝入體內(nèi)后不會(huì)被口腔和消化道中蛋白酶分解而失活。發(fā)酵液上清經(jīng)鏈酶蛋白酶處理后抑菌活性完全消失(7.88±0.14)mm，說明目標(biāo)抑菌物質(zhì)可能存在肽類結(jié)構(gòu)[21-22]。

2.4 菌株P(guān).bovis BD3526抑菌物質(zhì)的適用pH范圍

從圖4可知，不同pH(2.0～10.0)的P.bovisBD3526發(fā)酵上清液對(duì)S.mutantsATCC35668的抑制效果維持在21 mm左右，且與對(duì)照組無顯著差異，說明目標(biāo)抑菌物質(zhì)所具有較強(qiáng)的耐酸堿性能，寬泛的pH適應(yīng)性極大地提高該物質(zhì)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

圖4 不同pH條件下P.bovis BD3526發(fā)酵上清液的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of fermentation supernatant of P.bovis BD3526 at different pH values

2.5 菌株P(guān).bovis BD3526抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

由圖5可知，P.bovisBD3526抑菌物質(zhì)在100 ℃處理30 min后，仍能保持對(duì)S.mutantsATCC35668較好的抑菌活性。但在121 ℃溫度下，其抑菌圈直徑(19.77±0.25)mm，與對(duì)照組(21.33±0.32)mm相比，抑菌活性有所下降。這可能是在121 ℃超高溫條件下，肽類物質(zhì)中肽鍵更易發(fā)生部分?jǐn)嗔鸦蛘叻肿咏Y(jié)構(gòu)中某些官能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致抑菌活性降低。

圖5 不同溫度處理后P.bovis BD3526發(fā)酵上清液的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of fermentation supernatant of P.bovis BD3526 after different heat treatments

3 結(jié)論

本文主要涉及牛類芽孢桿菌P.bovisBD3526發(fā)酵麥麩合成具有體外抑制S.mutantsATCC35668生長(zhǎng)的研究。P.bovisBD3526以麥麩為培養(yǎng)介質(zhì)，在發(fā)酵36 h時(shí)活性菌到4.58 ×108CFU/mL、pH值5.20，抑菌圈直徑為(21.27±0.71)mm。該發(fā)酵上清液對(duì)口腔中常見的有益菌(植物乳桿菌和干酪乳桿菌)無抑制活性，但對(duì)鏈球菌屬的唾液鏈球菌和變形鏈球菌，有明顯地抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性、對(duì)消化系統(tǒng)蛋白水解酶和過氧化氫酶不敏感；經(jīng)鏈霉蛋白酶處理后抑菌活性消失，表明該抑菌物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有肽類成分。唾液鏈球菌K12是世界公認(rèn)的口腔益生菌，可以產(chǎn)生2種羊毛硫抗菌肽：唾液素A2和唾液素B，具有抑制多種口腔病原菌生長(zhǎng)活性。同樣，菌株P(guān).bovisBD3526也具有合成多種抗菌肽或細(xì)菌素能力，但抑菌物質(zhì)的分離、鑒定以及安全性評(píng)估還有待深入研究，為將來開發(fā)特異性功能食品配料或口腔護(hù)理產(chǎn)品奠定了重要的理論基礎(chǔ)。