兩株具有潛在益生作用的人源鏈球菌的安全性評價

王楠，田晗，張文曉，白筱翠，肖純凌

(環(huán)境與健康重點實驗室(沈陽醫(yī)學院)，遼寧 沈陽，110034)

呼吸道感染仍然是全球關注的健康問題，具有多發(fā)性且易反復，臨床多采用抗生素治療。但是抗生素的使用可能會導致呼吸道菌群豐度和多樣性的下降，從而增加致病菌定植的危險[1]，同時致使各種耐藥菌不斷出現(xiàn)，為臨床感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)。而“細菌療法”可以為預防或治療細菌感染提供一種有效的替代抗生素的方法?！凹毦煼ā笔侵竿ㄟ^使用益生菌干擾病原體的一種新的治療手段[2]。益生菌是一類攝入適當劑量后對宿主健康有益的“活的微生物”的總稱，被廣泛應用于食品、畜牧等領域[3-4]。益生菌通?？煞?大類：乳桿菌類、雙歧桿菌類、革蘭氏陽性球菌類。益生菌的作用機制主要是通過分泌抗菌物質、營養(yǎng)競爭、形成益生菌膜等干擾或抑制病原菌的生長[5]。益生菌作為抗生素的有效替代品，有助于重建菌群平衡，同時防止或減少致病菌的黏附和定植機會[6]。大量研究結果表明，益生菌在調節(jié)人體微生態(tài)平衡、治療腸道疾病[7]、預防過敏性疾病[8]等多個方面發(fā)揮重要作用。目前,對腸道益生菌產品的研究最廣泛[9]，對呼吸道益生菌的開發(fā)和利用尚不足。因此，有學者提出篩選健康人群口咽部正常菌群中的優(yōu)勢菌作為研究呼吸道益生菌的候選菌株[10]。甲型鏈球菌如唾液鏈球菌、緩征鏈球菌、口腔鏈球菌等是定植在人體上呼吸道的正常菌群，在健康兒童口咽部菌群中占主導地位[11-12]。研究表明，甲型鏈球菌在體內外對致病菌具有明顯的拮抗作用[13]。BIDOSSI等[14]發(fā)現(xiàn)唾液鏈球菌 24SMB和口腔鏈球菌 89A具有抑制所選病原體的生物膜形成的能力。王沖等[15]通過小鼠模型證實甲型鏈球菌能抑制病原菌在黏膜上皮細胞定植,保護小鼠呼吸道的菌群平衡。ROOS等[16]用甲型鏈球菌協(xié)同抗生素治療咽炎和中耳炎，可以有效的降低復發(fā)率。這些研究都表明甲型鏈球菌作為呼吸道的優(yōu)勢菌群，在維護上呼吸道菌群平衡，防治呼吸道感染等方面具有重要作用。

甲型鏈球菌作為良好呼吸道益生菌的候選菌株，其安全性也是關注的熱點。但是目前國內外對于鏈球菌的安全性評價沒有統(tǒng)一標準和方法，目前相關性研究都是從耐藥性、毒力基因和動物實驗等方面進行評價的。本課題組在健康兒童口咽部通過分離篩選得到了2株對金黃色葡萄球菌等多種致病菌具有拮抗作用的甲型鏈球菌，通過急性毒性實驗，細菌移位能力評價及抗生素敏感性檢測，對2株益生菌進行體內外安全性初步評價，以期為人源性呼吸道益生菌制劑的開發(fā)提供基礎研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與動物

實驗菌株1-4和4-2均為通過健康兒童口咽部菌群分離篩選后得到的具有廣譜拮抗作用的菌株。

動物為SPF級昆明種小鼠(雌雄各半)，由遼寧省長生生物技術股份有限公司提供。生產許可證號：SCXK(遼)2 015-0001。本研究嚴格遵守沈陽醫(yī)學院動物護理與實驗倫理委員會審查和批準的要求進行,動物倫理實驗編號為2015052902。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株處理

將菌株接種于含有5%脫纖維羊血的BHI營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h對其進行平板菌落計數(shù)。無菌條件下，刮取菌落溶于無菌生理鹽水中，配制菌體濃度為1×108、1×109、1×1010CFU/mL，制備為低、中、高劑量的口服菌懸液，用于急性毒性實驗。

1.2.2 動物分組與飼養(yǎng)

SPF級昆明種小鼠，體重為(20±2) g，適應性飼養(yǎng)7 d后，按照隨機分組原則分為7組，每組雌雄各5只，分別為生理鹽水對照組，菌株1-4高劑量組，菌株1-4中劑量組，菌株1-4低劑量組，菌株4-2高劑量組，菌株4-2中劑量組，菌株4-2低劑量組。實驗期間小鼠同室分籠喂養(yǎng)，自由采光和飲水。

1.2.3 急性毒性實驗

本實驗參照GB 15193.3—2014《食品安全國家標準 急性經口毒性試驗》和《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范2003版》的要求進行操作。適應飼養(yǎng)結束后，實驗組小鼠給予口服相應濃度的菌懸液處理，對照組小鼠給予生理鹽水口服處理，劑量為2 mL，口服1次。7 d內連續(xù)觀察小鼠的活動狀態(tài)，毒性跡象以及死亡情況，每天對小鼠的體重和采食量進行稱重記錄。結束后稱重并用頸椎脫臼法處死小鼠，進行解剖檢查，計算心、肝、脾、肺、腎的臟器指數(shù)。

1.2.4 細菌移位實驗

無菌操作取小鼠心、肝、脾、肺、腎臟器的組織各1 g勻漿，用無菌L棒涂布于含有5%脫纖維羊血的BHI瓊脂平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，觀察是否出現(xiàn)特征菌落。

1.2.5 耐藥性檢測

選取10種常見的抗生素藥敏紙片包括萬古霉素、利奈唑胺、氨芐西林、紅霉素、青霉素、氯霉素、克林霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松。采用藥敏紙片擴散法進行藥敏實驗。配制0.5麥氏的菌懸液，取100 μL的菌懸液涂布于MH固體培養(yǎng)基待完全吸收后，將藥敏紙片放在培養(yǎng)基上，靜置15 min后，放入細菌培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 急性毒性實驗

2.1.1 小鼠體重和采食量

不同菌株口服急性毒性實驗期間，未出現(xiàn)小鼠死亡情況，小鼠皮毛、飲水、軀體活動和行為模式均表現(xiàn)正常，未發(fā)現(xiàn)急性中毒體征和相關的毒性反應。體重和采食量急性毒性實驗中重要的判斷指標。實驗過程中，菌株1-4和4-2不同劑量組小鼠的體重增長趨勢正常(圖1和圖2)，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 菌株1-4小鼠體重增長趨勢Fig.1 Changes in body weight of strains 1-4 in mice

圖2 菌株4-2小鼠體重增長趨勢Fig.2 Changes in body weight of strains 4-2 in mice

對給予口服菌株1-4和4-2處理后7 d內小鼠的平均采食量進行統(tǒng)計分析，結果如表1所示。菌株1-4和4-2口服對雄性小鼠的采食量無影響(F=0.903，P=0.454；F=0.283,P=0.599)，口服菌株1-4和4-2的雌性小鼠7 d內的平均采食量較對照組相比有不同程度的降低，但與對照組相比無顯著統(tǒng)計學差異(F=0.56,P=0.457,F=0.781,P=0.068)。實驗表明口服菌株1-4和4-2對小鼠的體重和進食量沒有影響。

表1 給藥后各組小鼠采食量Table 1 Feed intake of each group after administration

2.1.2 臟器指數(shù)變化

7 d實驗結束后，對小鼠進行解剖，肉眼觀察并未發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、肺、腎等臟器異常，用生理鹽水清洗稱重后，計算臟器指數(shù)，結果如表2所示。經結果統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)口服不同菌株的小鼠臟器指數(shù)與生理鹽水對照組均無顯著性差異。(P>0.05)。說明菌株1-4和4-2對小鼠主要內臟器官無有害影響。

表2 臟器指數(shù)Table 2 Viscera index

2.2 細菌移位實驗

取小鼠心、肝、脾、肺、腎臟器組織勻漿，涂布于含有5%脫纖維羊血的BHI瓊脂平板上，經37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后未觀察到與菌株1-4和菌株4-2相似的灰白色，針尖樣大小的α溶血性鏈球菌菌落。實驗結果表明小鼠口服菌株1-4和4-2后，沒有發(fā)生細菌移位生長的現(xiàn)象。

2.3 耐藥性檢測

本試驗檢測了菌株1-4和4-2對常見10種抗生素的敏感性，參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)M100 S27標準進行判斷實驗結果顯示兩株菌對大部分抗生素具有較高的敏感性，菌株1-4對頭孢曲松表現(xiàn)為抗性，4-2菌株對紅霉素具有抗性，具體結果見表3。

表3 菌株耐藥性結果Table 3 Results of bacterial strain resistance

有研究表明大多數(shù)甲型鏈球菌可以合成核糖體甲基化酶，使23S rRNA的特定腺嘌呤甲基化從而阻斷大環(huán)內酯類藥物與核糖體的結合，鏈球菌屬多個菌株對紅霉素等大環(huán)內酯類藥物具有普遍耐受性。

3 結論與討論

目前人們對腸道益生菌產品研究最廣泛，對呼吸道益生菌的開發(fā)和利用尚不足。甲型鏈球菌作為口咽部菌株的主要定植者，可以分泌細菌素或抗菌肽等抑菌產物來抑制有害菌的生長且具有較好的黏附力，是人類口服益生菌的良好候選菌[17]。本研究在健康兒童口咽部經過分離篩選后得到2株對金黃色葡萄球菌等多個致病菌具有抑菌作用的甲型鏈球菌，但其安全性還需要進行初步的評價。

動物模型是評價益生菌安全性的常用手段，為期7 d的急性毒性實驗結果表明，口服不同劑量的益生菌實驗期間，小鼠生理狀態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)死亡和急性中毒體征。各組小鼠的體重均有增加，體重增長趨勢與采食量的變化相吻合。小鼠體重和采食量的變化，實驗組與對照組無統(tǒng)計學差異。結果表明口服2株菌對小鼠的健康指標無負面影響。解剖后，心、肝、脾、肺、腎主要內臟器官均無異常，各實驗組臟器指數(shù)與生理鹽水對照組無統(tǒng)計學差異。益生菌移位可能引發(fā)感染，包括菌血癥、敗血癥或心內膜炎等[18]，因此細菌移位生長能力也是評級益生菌安全性的重要指標，小鼠的臟器組織勻漿在BHI營養(yǎng)瓊脂平板經培養(yǎng)后，未發(fā)現(xiàn)與菌株1-4和4-2相同的灰白色，針尖樣大小的菌落，證實2株菌在小鼠體內不會發(fā)生細菌移位生長現(xiàn)象，體內實驗結果表明，口服2株益生菌對小鼠無毒性作用。益生菌安全性另一個非常重要的方面是其耐藥性，肉湯稀釋法和紙片擴散法常用來檢測菌株的藥物敏感性，肉湯稀釋法能夠準確的檢測最低殺菌濃度和最低抑菌濃度,但操作繁瑣，費時費力。K-B紙片擴散法操作起來相對簡便且成本小，因此成為目前評價抗生素敏感性應用最多的藥敏方法[19]。本研究通過紙片擴散法評價2株菌對常見抗生素的敏感性，參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)M100 S27標準進行判斷。結果顯示2菌株對大多數(shù)抗生素具有高度敏感性，菌株4-2和1-4分別對紅霉素和頭孢曲松表現(xiàn)為低敏感性，但沒有提取耐藥質粒。本研究選取的是呼吸道疾病常用的抗生素，對其他的抗生素是否具有抗性在后續(xù)研究應當補充。

綜合上述實驗結果，甲型鏈球菌1-4和4-2被證實對小鼠無急性毒性作用，表現(xiàn)為較高的移位安全性，對多數(shù)常見抗生素普遍敏感，初步表明具有良好的安全性，為其日后的開發(fā)和應用提供研究基礎。但是為了提供更加全面的安全性評價，在接下來的研究中，我們應該繼續(xù)研究其毒力基因，異常代謝以及慢性毒性實驗等，進一步驗證其作為呼吸道益生菌的安全性。