UPLC法對大理州滇重樓的品質(zhì)評價研究

管鑫，楊青淑，段寶忠,2，張海珠,2，夏從龍,2*

(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省高校滇西道地藥材資源開發(fā)重點實驗室，云南 大理671000)

0 引言

重樓為百合科重樓屬植物(Paris L.)的總稱，以“蚤休”之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。2015版《中國藥典》收載了滇重樓Paris polyphylla Smith var. Yunnanensis(Franch.)Hand-Mazz.和七葉一枝花Paris. polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara，以其地下根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，是“云南白藥”、“季勝德蛇藥片”等著名中成藥的主要原料[1-5]。該屬植物主要含有甾體皂苷類、三萜類、黃酮類化合物，具有鎮(zhèn)痛、止血、抗腫瘤、抑菌等活性[6,7]。

在李恒分類系統(tǒng)[8]下，重樓屬共24個種，分布在歐亞大陸的熱帶及溫帶地區(qū)，我國有19種，分布較廣，特別是在云南、貴州、四川等高海拔的西南省區(qū)種類最為豐富。其中，大理州有悠久的種藥和用藥傳統(tǒng)，獨特的民族文化為民族藥業(yè)的發(fā)展奠定了深厚的基礎(chǔ)，是云南省種植重樓等道地藥材，發(fā)展“云藥”產(chǎn)業(yè)的重要原料基地[7,9]，滇重樓又為藥典收載的品種。因此，本實驗對大理州滇重樓進(jìn)行研究。由于重樓種子休眠時間長，生長過程也十分緩慢，從種子萌發(fā)到可作為藥材收獲一般需要較長時間。而重樓作為多種中成藥的主要原料，需求市場遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于供應(yīng)市場，導(dǎo)致其供不應(yīng)求，價格昂貴，近幾年來甚至突破1000元/kg[7,9]。雖已有學(xué)者對重樓采收年限進(jìn)行研究[12,13]，但尚未有大理區(qū)域內(nèi)滇重樓的種植規(guī)化研究，因此，我們可以通過UPLC法對大理滇重樓根莖中5種重樓皂苷(Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H)進(jìn)行含量測定，并對其進(jìn)行分析比較，為探究大理滇重樓采收年限及種植區(qū)域規(guī)化提供一定參考依據(jù)。

1 材料

儀器：Agilent 1290 超高效液相色譜儀(美國Agilent有限公司公司)、超聲波清洗機(SB25-12D型，寧波新芝生物科技股份有限公司)、分析電子天平、十萬分之一電子天平(AL104型，梅特勒-托利多上海有限公司)、FY135型中草藥粉碎機(永康市金穗機械制造廠)。

對照品與試劑：對照品重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111590-201604、111591-201604、111592-201604、111593-201604，純度均達(dá)98%以上)，重樓皂苷H(北京融誠鑫德科技發(fā)展有限公司，批號分別為C-035-161001，純度達(dá)98%以上)，色譜級乙腈，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

供試藥材：9批(S1-S9)樣品均為8年生重樓，來自大理州不同地區(qū)，5批(Y1～Y5)樣品均采自大理永平基地，分別為5、6、7、9、10年生重樓，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥學(xué)教研室夏從龍教授鑒定為百合科(Lilliaceae)重樓屬(Paris L.)滇重樓Paris polyphylla Smith var. Yunnanensis(Franch.)Hand-Mazz.，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品0.0030g，加甲醇溶解后定容到10mL容量瓶中，搖勻，配成的對照品的濃度分別為重樓皂苷Ⅰ為0.3592g/L，重樓皂苷Ⅱ為0.3425g/L，重樓皂苷Ⅵ為0.3386g/L，重樓皂苷Ⅶ為0.3335g/L，重樓皂苷H為0.3288g/L。

2.2 供試品溶液的制備

將各供試藥材粉碎，稱取各供試藥材0.5g，放入具塞錐形瓶中，加3mL甲醇后超聲30min，重復(fù)三次，均取上清液過濾后用甲醇定容到10mL容量瓶中，搖勻，用時用0.22μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

資生堂C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0-2min，28%-30%A；2-9min，30%A-36%A;9-14min，36%A-39%A；14-19min，39%A-44%A；19-32min，44%A-50%A；32-50min，50%A)見表1，檢測波長203nm，流速0.8mL·min-1，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

取對照品溶液分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10μL，在2.3色譜條件下，將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”得到重樓皂苷I 、II、VI、VII、H對照品峰面積。以對照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得到準(zhǔn)曲線見表2。

2.4.2 精密度試驗

取S1的供試品溶液，進(jìn)樣量為10μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD均＜1.0%，表明此方法精密度較好。

2.4.3 重復(fù)性試驗

取6份S1供試品溶液，按上述色譜條件，每次進(jìn)樣量為10μL，峰面積RSD均＜3%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.4 加樣回收率試驗

取6份S1樣品，每份約0.5g，分別加入重樓皂苷I、重樓皂苷II、重樓皂苷VI、重樓皂苷VII、重樓皂苷H，按上述方法制備，測得加樣回收率為99.12%、98.88%、98.67%、98.22%、99.08%。且RSD為0.32%～0.95%。

2.5 結(jié)果與分析

2.5.1 大理州同產(chǎn)地不同生長年限滇重樓根莖主要皂苷類成分含量分析

大理州同產(chǎn)地(大理永平基地)分別為5、6、7、8、9、10年生滇重樓含量測定色譜圖，見圖1。不同年限滇重樓根莖中重樓皂苷I、II、VI、VII、H及2015版《中國藥典》規(guī)定重樓皂苷I、II、VI、VII的總含量，見表3。結(jié)果顯示，不同年限滇重樓根莖中均檢測到2015版《中國藥典》規(guī)定重樓皂苷I、II、VI、VII，其總含量范圍在1.186～4.170%，均大于2015版《中國藥典》規(guī)定的0.60%的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，大理州不同生長年限滇重樓根莖中重樓皂苷的總含量總體呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢，5～8年總含量逐年增加，8年總含量為最高，9年以上生重樓皂苷總含量較7、8年生均減少，因此，建議大理滇重樓采收季節(jié)在7～8年。

表1 滇重樓的樣品信息表

表2 重樓皂苷I、II、VI、VII、H 線性范圍考察

圖1 大理永平基地5～10年生滇重樓UPLC圖譜

圖2 重樓皂苷I、II、VI、VII、H混合對照品（A）及滇重樓根莖（B）色譜圖

表3 大理永平基地5～10年滇重樓含量測定結(jié)果

表4 大理州不同地區(qū)8年生滇重樓含量測定結(jié)果

2.5.2 大理州不同產(chǎn)地滇重樓根莖主要皂苷類成分含量分析

大理州不同產(chǎn)地滇重樓根莖中重樓皂苷I、II、VI、VII、H含量，見表4，色譜圖見圖2。結(jié)果顯示，大理州不同產(chǎn)地滇重樓根莖中均檢測到藥典規(guī)定的4種重樓皂苷I、II、VI、VII，其總含量的范圍在0.765%～4.170%，均大于2015版《中國藥典》一部規(guī)定的0.60%的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，5種重樓皂苷總含量由大到小依次為S5(大理永平基地)＞S6(大理鶴慶)＞S1(大理大學(xué)教學(xué)實踐基地，大理古城)＞S3(大理漕澗)＞S7(大理劍川)＞S4(大理巍山青華村)＞S2(大理賓川)＞S9(大理漾濞箐口村)＞S8(大理巍山三鶴村)，其中含量最高的為S5(大理永平基地)，最低的為S8(大理巍山三鶴村)，相差5倍多。大理州不同產(chǎn)地8年生滇重樓主要成分含量存在差異，但總體品質(zhì)都達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。對于大理州種植區(qū)域以大理永平，大理鶴慶，大理大學(xué)教學(xué)實踐基地(大理古城)為佳，五種重樓皂苷(I、II、VI、VII、H)總含量均大于1.5%。

3 討論

筆者對大理永平基地不同年限6批(Y1～Y5，S5)滇重樓根莖中重樓皂苷I、II、VI、VII、H進(jìn)行含量測定，6批樣品均檢測到5種重樓皂苷(I、II、VI、VII、H)。結(jié)果顯示，大理不同生長年限滇重樓根莖中5種重樓皂苷的總含量總體呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢，5～8年5種重樓皂苷含量隨年限增長而增加，9年及以上生滇重樓較7、8年生5種重樓皂苷含量均減少，含量最高的為8年生滇重樓?？紤]時間、成本等因素，建議大理滇重樓采收年限為7～8年。這與趙庭周等[13]研究結(jié)果吻合，滇重樓中重樓皂苷含量隨生長年份的增長而增加，第7年含量較高。也有相關(guān)文獻(xiàn)對重樓其他種進(jìn)行研究[9-10]，如南重樓，長柱重樓等，研究發(fā)現(xiàn)采收期也在7～8年。對不同產(chǎn)地9批(S1～S9)8年生滇重樓根莖中重樓皂苷I、II、VI、VII、H進(jìn)行含量測定，9批樣品均檢測到5中重樓皂苷(I、II、VI、VII、H)。結(jié)果表明，大理州不同地區(qū)同年生滇重樓5種重樓皂苷含量存在差異，5種重樓皂苷總含量由大到小順序依次為S5(大理永平基地)＞S6(大理鶴慶)＞S1(大理大學(xué)教學(xué)實踐基地，大理古城)＞S3(大理漕澗)＞S7(大理劍川)＞S4(大理巍山青華村)＞S2(大理賓川)＞S9(大理漾濞箐口村)＞S8(大理巍山三鶴村)，含量最高的大理永平基地與含量最低的大理巍山三鶴村相差5倍多，其中永平、鶴慶、大理大學(xué)教學(xué)實踐基地5種重樓皂苷總含量均大于1.5%，大于藥典規(guī)定量的2.5倍，因此，大理滇重樓種植基地建議在大理永平、大理鶴慶、大理大學(xué)教學(xué)實踐基地。

本實驗通過超高效液相色譜法對大理州同地區(qū)不同生長年限及不同地區(qū)同生長年限滇重樓根莖中處理皂苷含量進(jìn)行測定，為大理州滇重樓采收時間及種植區(qū)域規(guī)化提供了一定的參考依據(jù)，但尚未涉及大理州全部地區(qū)，今后還將收集檢測更多大理州不同地區(qū)滇重樓的樣品，為大理州種植區(qū)域規(guī)化得出進(jìn)一步的結(jié)論。