甘蔗β-胡蘿卜素異構(gòu)酶基因家族的鑒定、定位和表達(dá)分析

黃 寧 惠乾龍 方振名 李姍姍 凌 輝 闕友雄 袁照年,*

1 福建農(nóng)林大學(xué)國家甘蔗工程技術(shù)研究中心, 福建福州 350002; 2 玉林師范學(xué)院農(nóng)學(xué)院, 廣西玉林 537000

分蘗或分枝是水稻、小麥、大麥和甘蔗等禾本科植物生長發(fā)育過程中普遍存在的一種發(fā)育生物學(xué)現(xiàn)象[1-2], 也是一種影響作物產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀,通常受植物激素[3-4]、生物脅迫[5-6]及非生物脅迫調(diào)控[7-8]。甘蔗是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的糖料作物,蔗莖是糖分儲藏和收獲的重要部位, 獲得更多有效分蘗莖, 能夠提高甘蔗產(chǎn)量[9]。甘蔗有效分蘗莖是由主莖地下基部未伸長節(jié)間的側(cè)芽發(fā)育而來的成熟個體[2]。當(dāng)受黑穗病菌侵染后, 甘蔗分蘗增多、蔗莖變細(xì), 蔗梢長出黑鞭, 引起其有效莖數(shù)及蔗莖中蔗糖含量嚴(yán)重下降, 最終導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量降低和品質(zhì)變劣[10]。

1966年, Cook等[11]首次從棉花根系中分離得到一類萜類小分子化合物—獨腳金內(nèi)酯(strigolactones,SLs), 能夠抑制植物分蘗或分枝[12-13], 調(diào)控植物對各種生物和非生物脅迫的響應(yīng)[14]。β-胡蘿卜素異構(gòu)酶(D27)可以產(chǎn)生獨腳金內(nèi)酯前體或中間產(chǎn)物, 調(diào)控獨腳金內(nèi)酯生物合成[15]。據(jù)報道, 水稻[16]和擬南芥[15]中D27基因突變體均表現(xiàn)為分枝增多。小麥TaD27基因沉默突變體植株分蘗數(shù)增多, 而過表達(dá)小麥TaD27突變體植株分蘗數(shù)減少[17]。

迄今, 關(guān)于甘蔗D27基因, 只有1篇基因克隆及其組織特異性和非生物脅迫下表達(dá)模式的報道[18],尚未見該基因家族鑒定在甘蔗中的研究報道。本研究首先在甘蔗原始親本割手密種基因組中鑒定D27基因家族, 并進(jìn)行生物信息學(xué)分析; 其后, 基于植物生長調(diào)節(jié)劑處理相關(guān)和受黑穗病菌侵染相關(guān)甘蔗栽培種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 對甘蔗栽培種中與割手密種D27基因家族同源基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析; 最后,篩選并克隆出1個同時參與分蘗和響應(yīng)黑穗病菌脅迫的甘蔗栽培種D27基因, 并對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 多種脅迫下的表達(dá)定量和亞細(xì)胞定位分析。研究旨在為解析D27在甘蔗分蘗過程及與黑穗病菌互作過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 甘蔗割手密種D27基因家族鑒定

Waters等[15]發(fā)現(xiàn), 在91個真核生物D27蛋白序列中, 均包含1個功能未知的保守結(jié)構(gòu)域DUF4033,使用NCBI中的conserved domains工具檢索發(fā)現(xiàn)包含該結(jié)構(gòu)域的蛋白, 通過將反式-β-胡蘿卜素異構(gòu)成9-順式-β-胡蘿卜素, 參與 SL 的生物合成, 可使用DUF4033檢索 D27蛋白家族。以甘蔗原始親本割手密種基因組的基因序列、蛋白序列及染色體位置信息為基礎(chǔ), 結(jié)合甘蔗栽培種轉(zhuǎn)錄組序列, 構(gòu)建甘蔗基因家族鑒定模型。通過在線數(shù)據(jù)庫(http://www.life.illinois.edu/ming/downloads/Spontan eum_genome/)[19]下載甘蔗割手密種基因組相關(guān)信息。使用 TBtools軟件[20]中的 HMM 檢索(Simple HMM Search)工具, 以DUF4033為探針在割手密種基因組的蛋白序列中進(jìn)行檢索, 獲得割手密種D27基因家族成員所編碼的蛋白序列。同時利用DNAMAN軟件中的多序列比對(multiple alignment)工具, 計算割手密種D27基因家族成員間氨基酸序列的相似性。最后分別通過 TBtools軟件[20]中的基因位置可視化(Gene Location Visualize)工具和熱圖(Heatmap)工具繪制割手密種D27基因家族成員的染色體分布圖和基因家族成員間氨基酸序列相似性熱圖。

1.2 甘蔗割手密種 D27基因家族的生物信息學(xué)分析

1.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及結(jié)構(gòu)域分析 使用interpro在線軟件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)檢索DUF4033, 分別下載擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativasubsp.)、高粱(Sorghum bicolor)、小米(Setaria italica)和玉米(Zea mays)中的 D27s氨基酸序列, 同時利用MEGA7.0軟件對甘蔗割手密種及其他5個物種中的D27s氨基酸序列進(jìn)行多序列比對, 并使用最大似然法(Maximum Likelihood Method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (Bootstrap = 1000)。使用 Smart search在線工具 (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1) 檢索 6個物種中D27s氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域, 并通過TBtools軟件[20]中的基因結(jié)構(gòu)查看(gene structure viewer)工具進(jìn)行展示。

1.2.2 順式元件預(yù)測 基于甘蔗割手密種基因組染色體位置信息, 使用TBtools軟件[20]中的Gtf/Gff3序列提取(Gtf/Gff3 sequences Extract)工具, 提取甘蔗割手密種D27基因家族成員CDS上游2000 bp的啟動子序列, 將提取到的序列提交至 PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式元件預(yù)測。同時, 使用TBtools軟件[20]中的生物序列查看(BioSequence viewer)工具對甘蔗割手密種D27基因家族成員的順式元件進(jìn)行可視化。

1.3 甘蔗栽培種ScD27.1基因的篩選與克隆

1.3.1 植物材料及處理 參考 Ling等[22]的方法培養(yǎng)甘蔗主要栽培品種 ROC22組培苗, 分別使用 ABA (100 μmol L-1)、MeJA (100 μmol L-1)、SA(5 mmol L-1)和H2O2(500 mmol L-1) 水溶液處理長勢一致的組培苗, 并于0 h和6 h取整株組培苗作為樣品, 保存于-80°C。

1.3.2 總 RNA提取和 cDNA合成 采用TRIzol法提取甘蔗總RNA后, 使用DNaseI對RNA樣品進(jìn)行處理, 同時使用 PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect for Real Time)合成cDNA。

1.3.3 差異表達(dá)ScD27.1基因篩選 項目組前期研究發(fā)現(xiàn), 甘蔗受6-BA (6-benzylaminopurine, 2 mg L-1)和DA-6 (Diethylaminoethylhexanoate, 10 mg L-1)共同誘導(dǎo)后分蘗增多, 同時前人研究表明, 黑穗病菌侵染導(dǎo)致甘蔗分蘗增多[10], 說明植物生長調(diào)節(jié)劑(6-BA和 DA-6)和黑穗病菌均引起了甘蔗分蘗相關(guān)代謝途徑調(diào)控基因的變化。因此, 本研究以甘蔗割手密種D27基因家族所編碼的氨基酸序列為探針,分別在6-BA (2 mg L-1)和DA-6 (10 mg L-1)共同誘導(dǎo)的甘蔗栽培種 ROC22轉(zhuǎn)錄組 (數(shù)據(jù)未公布)和黑穗病菌脅迫的甘蔗栽培種ROC22和YC05-179轉(zhuǎn)錄組[21]數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行tblastn比對, 提取與甘蔗割手密種D27基因家族同源的甘蔗栽培種D27基因家族在2個轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)數(shù)據(jù), 篩選2個轉(zhuǎn)錄組中均差異表達(dá)的甘蔗割手密種D27基因。

1.3.4ScD27.1基因的克隆和分析 以在 6-BA(2 mg L-1)和DA-6 (10 mg L-1)共同誘導(dǎo)(數(shù)據(jù)未公布)和黑穗病菌脅迫的甘蔗栽培種轉(zhuǎn)錄組[21]中均差異表達(dá)的甘蔗割手密種D27基因 Sspon.06G0012830-1A的序列作為參考設(shè)計PCR擴(kuò)增引物ScD27.1-F/R (表1), 通過ExTaq酶(TaKaRa, 中國大連)在甘蔗栽培種ROC22整株組培苗cDNA中進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增程序如下: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min 30 s, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。目的片段PCR產(chǎn)物經(jīng)過Gel Extraction Kit (Omega, 中國北京) 純化后連接至pMD19-T載體, 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行TA克隆及測序。同時, 使用 ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)及 blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析測序結(jié)果。

1.4 甘蔗栽培種ScD27.1基因的表達(dá)分析

1.4.1 生物信息學(xué)分析 分別使用在線工具ExPaSy (http://web.expasy.org/protparam/)和 Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pa ge=/NPSA/npsa_hnn.html)預(yù)測 ScD27.1一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu); 同時使用 Plant-PLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant/)、ProtComp 9.0 (http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)和WoLFPSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)工具預(yù)測 ScD27.1亞細(xì)胞定位; 分別使用 TargetP-2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/index.php)、UbPred (http://www.ubpred.org/)和NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對 ScD27.1進(jìn)行靶向肽類型、泛素化位點及磷酸化位點分析。

1.4.2 qRT-PCR表達(dá)分析 參考甘蔗割手密種D27基因家族順式元件預(yù)測結(jié)果, 分析參與植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的植物激素信號分子 ABA、MeJA、SA[32-33]和H2O2[34]如何調(diào)控甘蔗D27基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。使用 qRT-PCR技術(shù), 以 q-ScD27.1-F/R(表1)為引物,CAC和CUL為內(nèi)參基因[22], 分析ScD27.1基因在ABA、MeJA、SA和H2O2脅迫下的表達(dá)模式。為了獲得準(zhǔn)確基因相對表達(dá)分析結(jié)果,在3倍梯度稀釋的ROC22 cDNA樣品中對ScD27.1基因的定量引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增檢測和擴(kuò)增效率檢測。基因的相對表達(dá)量計算及差異顯著性分析分別使用 2-ΔΔCT算法[23]和新復(fù)極差法 DPS (7.05)。qRT-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序均參照 SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書。

1.4.3 亞細(xì)胞定位分析 參考 Gateway BP Clonase II Enzyme mix (Invitrogen, 美國加利福尼亞)說明書, 以 pMD19-T-ScD27.1質(zhì)粒為模板,G-ScD27.1-F/R (表1)為引物, 構(gòu)建入門載體pDONR-Zeo-ScD27.1。根據(jù)Gateway LR Clonase II Enzyme mix (Invitrogen, 美國加利福尼亞)說明書,通過 LR反應(yīng)構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體pFAST-R06-ScD27.1。將 pFAST-R06和pFAST-R06-ScD27.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101并涂板(含50 μg mL-1壯觀霉素和 35 μg mL-1利福平), 28℃倒置培養(yǎng) 2 d后, 進(jìn)行菌液 PCR鑒定。分別將含有pFAST-R06 和 pFAST-R06-ScD27.1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射侵染煙草葉片表皮細(xì)胞(操作參考 Su等[24]),48 h 后, 用 16.5 μmol L-1的渥曼青霉素(Wortmannin,Wort)處理煙草葉片, 并在0 h和0.5 h后[25]通過激光共聚焦顯微鏡(Leica, 德國韋茨拉爾)觀察煙草葉片表皮細(xì)胞[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗割手密種D27基因家族鑒定

通過HMM共檢索到5個具有完整DUF4033保守結(jié)構(gòu)域的甘蔗割手密種D27序列, 分別為 Sspon.06G0012830-1A、Sspon.06G0012830-3C、Sspon.06G0016140-2C、Sspon.07G0014180-2B和 Sspon.07G0014180-3C, 分別定位于6A、6C、6C、7B、7C染色體(圖1-A)。多序列比對結(jié)果顯示, 甘蔗割手密種D27基因家族成員間的氨基酸序列一致性為 52.36%, 其中Sspon.07G0014180-2B與Sspon.07G0014180-3C一致性最高, 為 90.09%, Sspon.06G0016140-2C與 Sspon.07G0014180-2B一致性最低, 為20.41% (圖1-B), 說明甘蔗割手密種D27基因家族氨基酸序列間差異較大。

表1 引物列表Table 1 List of primers

2.2 甘蔗割手密種 D27基因家族的生物信息學(xué)分析

2.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及結(jié)構(gòu)域分析 使用甘蔗割手密種的5個D27s氨基酸序列與其他5個物種(擬南芥、水稻、高粱、小米及玉米)的62個D27s氨基酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果如圖2所示。6個物種的D27s蛋白聚類成7個系統(tǒng)發(fā)育分支, 定位于甘蔗割手密種7B染色體的Sspon.07G0014180-2B和7C染色體的Sspon.07G0014180-3C分布于分支I, 定位于6A染色體的Sspon.06G0012830-1A和6C染色體的 Sspon.06G0012830-3C分布于分支 V, 定位于6C染色體的Sspon.06G0016140-2C分布于分支VII,并且甘蔗割手密種D27s與高粱D27s 在系統(tǒng)發(fā)育分支中距離最近。Smart search檢索到的結(jié)構(gòu)域包括Pfam: DUF4033、Pfam: COesterase和Pfam: Abhydrolase_3等, 說明D27基因家族除了包含典型的 Pfam:DUF4033結(jié)構(gòu)域外, 還可能包含其他結(jié)構(gòu)域, 但這些結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中不保守。

2.2.2 順式元件預(yù)測 為了解甘蔗割手密種D27基因家族成員的調(diào)控功能, 使用PlantCare對甘蔗割手密種D27基因家族成員CDS上游2000 bp的啟動子序列進(jìn)行分析, 同時提取與脅迫響應(yīng)/誘導(dǎo)相關(guān)的14類順式元件(圖3)。其中與植物激素響應(yīng)相關(guān)的順式元件包括 ABA響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件、GA響應(yīng)元件和 SA響應(yīng)元件。與植物生長發(fā)育相關(guān)的順式元件包括玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件、分生組織表達(dá)調(diào)控元件、種子特異性調(diào)控元件和胚乳表達(dá)調(diào)控元件。與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式元件包括低溫響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、光響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)元件、防御和應(yīng)激反應(yīng)元件和傷害響應(yīng)元件。甘蔗割手密種D27基因家族所有成員的啟動子區(qū)均含有厭氧誘導(dǎo)元件、光響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件和 GA響應(yīng)元件。Sspon.06G0012830-3C和Sspon.06G0016140-2C的啟動子區(qū)分別含有特有的種子特異性調(diào)控元件和胚乳表達(dá)調(diào)控元件。推測厭氧誘導(dǎo)元件、光響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件和GA響應(yīng)元件相關(guān)的反式作用因子可能可以結(jié)合到甘蔗割手密種D27基因家族啟動子區(qū), 從而受植物激素響應(yīng)和脅迫誘導(dǎo)表且部分成員在特定組織器官中特異性表達(dá)。

2.3 甘蔗栽培種ScD27.1基因的篩選與克隆

2.3.1 差異表達(dá)ScD27.1基因篩選 經(jīng)tblastn比對后, 甘蔗割手密種D27基因家族在植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)甘蔗栽培種ROC22分蘗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中存在3條相似性較高的序列, 分別為 c116894.graph_c0、c112688.graph_c0和 c161113.graph_c0; 在甘蔗栽培種ROC22和YC05-179應(yīng)答黑穗病菌侵染轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中存在 3條相似性較高的序列, 分別為Sugarcane_Unigene.66941、Sugarcane_Unigene.58014和Sugarcane_Unigene.87626。D27s序列間相似性詳見表2。

6-BA和 DA-6誘導(dǎo)甘蔗栽培種 ROC22分蘗轉(zhuǎn)錄組中,c112688.graph_c0(P= 0.006)和c116894.graph_c0(P= 0.02)經(jīng)6-BA和DA-6處理后的表達(dá)量,相對于對照組均顯著性下調(diào)表達(dá), 且在處理20 d時下調(diào)表達(dá)幅度最大, 分別為對照組的-0.54和-0.42倍(圖4-A)。受黑穗病菌侵染后,Sugarcane_Unigene.58014在甘蔗抗黑穗病品種YC05-179和甘蔗感黑穗病品種 ROC22中均無顯著差異表達(dá);盡管Sugarcane_Unigene.66941在甘蔗抗黑穗病品種YC05-179受侵染后48 h和120 h的下調(diào)表達(dá)并不顯著, 但其在感黑穗病品種 ROC22受侵染后 48 h和120 h的上調(diào)表達(dá)均達(dá)到顯著水平(P= 0.01) (圖4-B)。此外, 由于c161113.graph_c0和Sugarcane_Unigene.87626在轉(zhuǎn)錄組中的 FPKM 值均小于 0.2,屬于極低表達(dá), 不符合數(shù)據(jù)分析要求。

表2 甘蔗割手密種與栽培種D27s間序列相似性Table 2 Sequence similarity between D27s from Saccharum spontaneum and sugarcane cultivar

綜上所述, 與甘蔗割手密種D27基因家族中Sspon.06G0012830-1A相似性分別為 97.93%和98.34%的甘蔗栽培種c116894.graph_c0和Sugarcane_Unigene.66941(表2)分別在 6-BA 和DA-6共同誘導(dǎo)甘蔗栽培種ROC22分蘗轉(zhuǎn)錄組和甘蔗栽培種 ROC22應(yīng)答黑穗病菌侵染轉(zhuǎn)錄組中顯著差異表達(dá), 推測與甘蔗割手密種Sspon.06G0012830-1A同源的甘蔗栽培種D27基因同時參與甘蔗分蘗調(diào)控及黑穗病菌響應(yīng), 可用于下一步的研究。

2.3.2ScD27.1基因克隆 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可知, PCR擴(kuò)增獲得1條約1127 bp的特異條帶(圖5-A)。PCR產(chǎn)物經(jīng)連接, 轉(zhuǎn)化后進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果經(jīng) ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析表明, 克隆所得的基因長1127 bp, 編碼 266個氨基酸(圖5-B)。經(jīng) blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對后發(fā)現(xiàn),其氨基酸序列與高粱 β-胡蘿卜素異構(gòu)酶 (GenBank登錄號為 XP_002444917.2)相似性為 91.82%, 因此將該基因命名為甘蔗 β-胡蘿卜素異構(gòu)酶基因(ScD27.1, GenBank登錄號為MT499895)。

2.4 甘蔗栽培種ScD27.1基因的表達(dá)分析

2.4.1 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示, 甘蔗栽培種ScD27.1編碼266個氨基酸, 等電點為8.91, 分子量為30.00 kD, 屬于不穩(wěn)定蛋白。二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋和無規(guī)則卷曲(表3)。甘蔗栽培種 ScD27.1具有葉綠體轉(zhuǎn)運肽可能定位于葉綠體,包含4個泛素化位點和18個磷酸化位點(表3)。

2.4.2 qRT-PCR表達(dá)分析ScD27.1基因引物擴(kuò)增效率為 1.026, 在 0.95～1.05之間, 擴(kuò)增曲線具有很好的相關(guān)性(R2= 0.9991), 說明引物具有良好的擴(kuò)增特異性(圖6-A)。受MeJA脅迫后,ScD27.1基因的表達(dá)量相對于對照組下調(diào)表達(dá); 受ABA、SA及H2O2脅迫后,ScD27.1基因的表達(dá)量相對于對照組上調(diào)表達(dá), 并且在受ABA和H2O2脅迫后顯著高于對照組,分別為對照組的 5.37倍和 4.60倍(圖6-B)。推測ScD27.1基因受 ABA及 H2O2顯著誘導(dǎo)表達(dá), 但對MeJA、SA脅迫響應(yīng)不明顯。

表3 生物信息學(xué)分析結(jié)果Table 3 Result of bioinformatics analysis

2.4.3 亞細(xì)胞定位分析 煙草葉片表皮細(xì)胞亞細(xì)胞定位結(jié)果如圖7所示, 空載35S::GFP定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞核, 35S::ScD27.1::GFP定位在細(xì)胞膜上,胞內(nèi)也出現(xiàn)了點狀熒光, 如葉綠體。Wort能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)液泡前體或者運輸小泡發(fā)生融合形成更大的膜泡結(jié)構(gòu)[25,27]。經(jīng)過Wort處理0.5 h后觀察發(fā)現(xiàn), 空載35S::GFP的定位未發(fā)生改變, 煙草葉片表皮細(xì)胞中未觀察到具有綠色熒光的膜泡結(jié)構(gòu)。然而, 盡管35S::ScD27.1::GFP的定位也未發(fā)生改變, 但在煙草葉片表皮細(xì)胞中可以觀察到含有綠色熒光的膜泡結(jié)構(gòu), 因此, ScD27.1可能定位于細(xì)胞膜和葉綠體, 并參與細(xì)胞內(nèi)膜泡運輸或由液泡前體、胞內(nèi)運輸小泡完成其在在胞質(zhì)內(nèi)的分揀運輸過程。

3 討論

SLs是一種廣泛存在、能夠抑制植物分蘗或分枝的植物激素[12-13]。目前, 在擬南芥[15]、水稻[16]和小麥[17]中均有關(guān)于SLs合成相關(guān)基因d27突變體中分蘗增多的報道, 說明D27基因能夠通過抑制 SLs合成來減少植物分蘗或分枝。本研究中,ScD27.1在分蘗相關(guān)轉(zhuǎn)錄組中的轉(zhuǎn)錄本 c116894.graph_c0, 經(jīng)6-BA和DA-6 (具有促進(jìn)分蘗功能)處理后相對于對照組, 顯著下調(diào)表達(dá), 與前人研究結(jié)果相同[15-17]。

SLs除了在生長發(fā)育過程中起作用外, 還被認(rèn)為能夠響應(yīng)病原菌侵染[28]。番茄SLs合成相關(guān)基因Slccd8突變體對灰葡萄球菌和鏈格孢菌均更敏感[29]。擬南芥 SLs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因Atmax2突變體對果膠桿菌和假丁香單胞菌的敏感性增加, 但對灰葡萄球菌的敏感性不增加[30]。擬南芥SLs生物合成(max1、max3和max4)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(max2)突變體對帶化紅球菌更加敏感[31]。甘蔗 SLs合成相關(guān)基因ScD27.1的同源基因Sugarcane_Unigene.66941在抗病品種中受黑穗病菌抑制表達(dá), 在感病品種中受黑穗病菌誘導(dǎo)表達(dá), 說明ScD27.1響應(yīng)黑穗病菌侵染,但其在甘蔗分蘗及甘蔗與黑穗病菌互作過程中的作用還需進(jìn)一步試驗驗證。

ABA、MeJA和SA作為重要的植物激素信號分子, 不僅能夠調(diào)控植物生長發(fā)育, 同時參與植物逆境反應(yīng)[32-33]?；钚匝踔饕?O2-和 H2O2, 也是植物中一種重要的信號分子, 在植物受病原體侵染或其生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用[34]。ScD27.1基因受ABA、SA及 H2O2脅迫后上調(diào)表達(dá), 受 MeJA脅迫后下調(diào)表達(dá), 但SA及MeJA脅迫下差異表達(dá)不顯著,推測ScD27.1基因受 ABA和H2O2誘導(dǎo)表達(dá), 不受MeJA和SA調(diào)控。Abuauf等[35]在ABA處理擬南芥?zhèn)雀髮tD27進(jìn)行表達(dá)分析, 得到了相似的結(jié)果。苜蓿根系在營養(yǎng)缺乏條件下, 激發(fā)活性氧生成的NADPH氧化酶活性增強, SLs合成相關(guān)基因MtCCD7、MtCCD8、MtD27基因上調(diào)表達(dá)[36], 說明活性氧與 SLs合成相關(guān)基因可能存在協(xié)同作用, 這與ScD27.1基因受H2O2誘導(dǎo)表達(dá)的研究結(jié)果相似。真核生物中由轉(zhuǎn)錄因子等反式作用因子結(jié)合基因啟動子區(qū)啟動基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄, 然而一般情況下反式作用因子常常形成同源或異源復(fù)合體行使其功能, 基因的表達(dá)往往不受單一順式元件調(diào)控。因此,ScD27.1基因的割手密同源基因啟動子區(qū)域雖然具有SA和MeJA響應(yīng)元件, 但ScD27.1也有可能在某些條件下不響應(yīng)SA和MeJA的誘導(dǎo)表達(dá)。

D27同源基因存在于藻類(藍(lán)藻)和高等植物,但不存在于動物或真菌中, 是一種植物特有蛋白[16]。本研究首次從甘蔗割手密種基因組中鑒定出D27基因家族的5個成員, 并從甘蔗栽培種ROC22中克隆出1個同時參與分蘗和黑穗病菌脅迫響應(yīng)的割手密種同源D27基因, 該甘蔗栽培種ScD27.1基因編碼266個氨基酸。該蛋白等電點為 8.91, 分子量為30.00 kD, 具有DUF4033結(jié)構(gòu)域, 與已報道的編碼288個氨基酸, 等電點為 5.04, 分子量為 71.58 kD,具有2個鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域的甘蔗D27基因[18]同源性為31.40%, 推測2個甘蔗D27基因同屬于甘蔗D27基因家族, 可能具有不同的生物學(xué)功能。目前關(guān)于D27亞細(xì)胞定位的報道較少, Waters等[16]發(fā)現(xiàn), 擬南芥D27定位于質(zhì)體, 水稻D27定位于葉綠體, 本研究中甘蔗 ScD27.1定位于細(xì)胞膜和葉綠體。隨著越來越多的D27s被發(fā)現(xiàn), D27的亞細(xì)胞定位研究將會更加深入。甘蔗割手密種D27基因家族順式元件預(yù)測結(jié)果顯示,D27s參與植物激素響應(yīng)、生長發(fā)育調(diào)控及脅迫響應(yīng)。其中關(guān)于D27參與ABA、MeJA和SA激素響應(yīng)已在本研究中驗證, 干旱脅迫[37]、光脅迫[38]和磷饑餓脅迫[39]調(diào)控已有相關(guān)報道。進(jìn)一步的研究中, SL在低溫脅迫[40]、種子萌發(fā)[41]和果實發(fā)育[42]過程中的作用可作為D27s相關(guān)調(diào)控功能研究的參考。

4 結(jié)論

本研究首次鑒定出5個甘蔗割手密種D27基因家族成員, 并對其進(jìn)行染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化、結(jié)構(gòu)域及順式元件分析。其后, 篩選并克隆到 1個在甘蔗分蘗轉(zhuǎn)錄組和甘蔗應(yīng)答黑穗病侵染轉(zhuǎn)錄組中均差異表達(dá)的甘蔗栽培種ScD27.1基因。該基因編碼266個氨基酸, 為等電點8.91、分子量30.00 kD的不穩(wěn)定蛋白, 二級結(jié)構(gòu)主要包括 α-螺旋和無規(guī)則卷曲。表達(dá)分析顯示, 該基因受 ABA和 H2O2誘導(dǎo)表達(dá), 不受 MeJA和 SA調(diào)控。亞細(xì)胞定位明確了ScD27.1蛋白定位于細(xì)胞膜和葉綠體。以上結(jié)果不僅為解析甘蔗ScD27.1基因在信號傳導(dǎo)機(jī)制及脅迫響應(yīng)機(jī)制中的功能作用提供參考, 還為深入了解甘蔗受黑穗病菌侵染后的抗病機(jī)制與分蘗表型之間的關(guān)系研究提供新思路。