水稻單倍體誘導基因OsMATL突變體的創(chuàng)制與分析

文 欽 賈思思 王加峰 黃翠紅 王 慧 陳志強 郭 濤

華南農業(yè)大學 / 國家植物航天育種工程技術研究中心, 廣東廣州 510642

水稻(Oryza sativaL.)是我國重要的糧食作物之一, 水稻的產量和品質直接影響著我國糧食安全與人民生活品質[1]。水稻品種的高效選育是提高水稻產量、品質和抗性的關鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)育種中需要6～8個世代連續(xù)自交和不斷選擇才能獲得相對穩(wěn)定的材料, 周期較長, 難以滿足水稻育種需求。雙單倍體育種(double haploid, DH技術)只需2個世代就能獲得純系, 大大縮短了育種進程, 是純系選育的一次技術革命[2]。單倍體的產生是雙單倍體育種的第一步,自然發(fā)生單倍體的頻率很低, 僅為 0.1%, 無法滿足育種的大量需求[3]。在水稻中, 利用花藥進行離體培養(yǎng), 誘導花藥產生愈傷組織再分化成單倍體植株,是產生水稻單倍體的主要方法。但是, 水稻的花藥培養(yǎng)具有嚴格的基因型依賴且操作復雜, 如秈稻的花藥培養(yǎng)能力顯著弱于粳稻[4]。因此, 水稻單倍體的產生一直是制約著水稻雙單倍體育種的瓶頸。

近年來, 在玉米中以生物誘導為基礎的 DH技術已被國內外種業(yè)公司及育種單位廣泛的應用, 成為了與分子標記輔助育種和轉基因技術并稱的現(xiàn)代玉米三大育種技術[5-6]。生物誘導產生孤雌生殖單倍體是利用單倍體誘導系作父本, 與目標選系基礎材料進行雜交, 在雜交當代的籽粒上就能獲得一定比例的母本血緣單倍體。利用誘導系產生單倍體具有不受基因型依賴、誘導過程簡單、成本低廉等優(yōu)勢。在玉米中, 誘導單倍體產生的性狀受主效QTL控制,其中qhir1能夠解釋66%遺傳變異[5]。2017年美國、中國和法國科學家?guī)缀跬瑫r克隆qhir1位點的花粉特異性磷脂酶 A 基因MTL/ZmPLA1/NLD(GRMZM2G471240)[7-9]。在玉米單倍體誘導系中,該基因在第 4外顯子 1572～1573之間有個 4 bp(CGAG)插入, 造成 20個氨基酸移碼突變, 導致翻譯提前終止, 產生單倍體誘導功能。

MTL在作物中高度保守, 利用基因編輯技術已成功在玉米[7-8,10]、水稻[11-12]和小麥[13-14]中實現(xiàn)以誘導基因MTL為基礎的單倍體誘導。先正達公司[11]對秈稻 IR58025B中MTL同源基因OsMATL(Os03g0393900)第1外顯子和第4外顯子進行編輯,突變體可誘導產生2%～6%的單倍體。王春等[12]對秈粳雜交稻春優(yōu)84中OsMATL第4外顯子進行編輯后單倍體誘導率為4.44%。玉米中MTL基因不同位點突變后單倍體誘導率不同, 水稻中OsMATL基因不同位點的突變是否會影響單倍體誘導率還有待探索。此外, 水稻材料的不同遺傳背景對單倍體誘導率的影響也未知, 因此獲得一個高誘導率的水稻單倍體誘導系對水稻雙單倍體育種有著重要的意義。本研究以粳稻日本晴和秈稻華航48為研究材料, 利用CRISPR/Cas9技術對OsMATL基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)的多個靶點進行編輯, 獲得了秈粳背景下不同類型的OsMATL突變體, 進一步分析了不同位點的突變效應, 為深入研究水稻孤雌生殖單倍體誘導的機制提供了基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為粳稻日本晴和秈稻華航48, 日本晴是典型的粳型純系品種, 華航48是國家植物航天育種工程技術研究中心選育的綜合性狀優(yōu)良的秈型純系品種。試驗材料水培種植于人工氣候室(溫度 28℃,光照10 h, 黑暗14 h), 所有材料常規(guī)管理。

1.2 OsMATL生物信息學分析

利用 Ensembl數(shù)據庫(https://plants.ensembl.org/index)獲取MTL的基因序列及氨基酸序列。通過NCBI數(shù)據庫中 Blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線分析, 搜索MTL在谷物和模式作物擬南芥中的同源基因, 并下載同源基因的氨基酸序列。利用 Clustl Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對氨基酸序列進行多序列比對[15-16]; 利用Pfam (http://pfam.xfam.org/)和UniProt(https://www.uniprot.org/)預測OsMATL基因蛋白結構域。選取OsMATL基因ATG上游2000 bp作為啟動子區(qū)域, 利用順式作用元件在線分析網站PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子序列, 預測順式作用元件[16]。利用SWISS MODEL網站(https://swissmodel.expasy.org/)進行蛋白三級結構預測[17]。

1.3 靶點及引物設計

利用 CRISPR-GE網站(http://skl.scau.edu.cn/)設計靶點[18], 在OsMATL編碼區(qū)第1外顯子、第3外顯子和第 4外顯子處設計單靶點; 在啟動子區(qū)設計雙靶點對順式作用元件進行敲除, 靶點序列及位置如圖1。根據選擇的靶點設計引物(表1), 由金唯智(廣州)生物科技有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 CRISPR/Cas9載體構建

參照謝卡斌等[19]利用 TPG 系統(tǒng)構建CRISPR/Cas9載體的方法。試驗步驟如下: (1)初級片段獲取。以pGTR質粒為模板, PCR擴增出含有靶點和PTG載體的片段; (2) PTG片段組裝。利用Golden Gate克隆方式將初級片段連接起來; (3) pRGEB32載體酶切。利用BsaI限制性內切酶酶切pRGEB32載體, 獲得與PTG相同的黏性末端; (4)重組載體構建。將PTG片段插入到酶切后pRGEB32載體中BasI克隆位點; (5)重組載體轉化。用熱激法將重組的載體轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α中; (6)陽性克隆檢測。挑取單個菌落接種培養(yǎng), 通過測序驗證載體正確性。CRISPR/Cas9載體構建如圖2所示。

1.5 農桿菌介導遺傳轉化

參照Hiei等[20]建立的水稻高效農桿菌介導的遺傳轉化法, 將構建好的 CRISPR/Cas9載體通過電擊轉化農桿菌EHA105中, 3個編碼區(qū)的單靶點載體分別轉化日本晴和華航48成熟胚誘導的愈傷組織中, 1個啟動子區(qū)的雙靶點載體轉化到華航48成熟胚誘導的愈傷組織中, 通過潮霉素抗性篩選T0代組培苗。

1.6 靶點檢測

提取轉基因水稻基因組 DNA, 在靶點上下游200 bp處設計引物, 對包含靶點目的片段進行擴增和測序, 將測序的結果放入在線解碼工具DSDecode(http://dsdecode.scgene.com/)解碼[21], 確定靶點突變情況。

1.7 OsMATL基因表達量分析

收集OsMATL啟動子區(qū)突變體和野生型散粉前新鮮的花藥, 于-80℃保存。采用TRIzol法提取成熟花粉RNA, 參照EvoM-MLV反轉錄試劑盒II說明書反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板,actin為內參, 參照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑說明書,在熒光定量PCR儀(ABI StepOnePlus)上進行qRT-PCR分析, 采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.8 突變體結實情況調查

調查OsMATL編碼區(qū)純合突變體和OsMATL啟動子區(qū)大片段缺失突變體主穗上結實情況, 分為實粒(籽粒飽滿透明)、敗育(只剩薄薄種皮或籽粒皺縮)以及空粒(穎殼內無籽粒), 并統(tǒng)計結實率和敗育率。利用SPSS進行單因素方差分析及 Duncan’s法多重比較, 差異顯著性水平為P≤0.01。

2 結果與分析

2.1 OsMATL生物信息學分析

對玉米MTL基因與水稻、高粱、小麥、大麥、小米和擬南芥中的MTL同源基因進行氨基酸序列多重比對(圖3)。結果顯示,MTL在谷類作物中的同源性較高, 達到70%以上, 玉米中MTL基因與水稻中同源基因OsMATL氨基酸序列相似性為 79%, 粳稻和秈稻中OsMATL基因氨基酸序列相似性高達99%。保守的氨基酸序列暗示MTL在谷類作物中具有相似的功能。水稻中OsMATL基因位于3號染色體上, 含有4個外顯子, 編碼432個氨基酸。該基因編碼花粉特異性磷脂酶, 有 1個類磷脂酶 A2結構域、1個?；D移酶/?；饷?溶血磷脂酶結構域、1個聚乳酸結構域、3個Motif (GXGXXG、GXSXG和DGA/G), 在C430處有S-棕櫚?；騍-法尼?；稽c, 具有脂類分解代謝和植物防御的功能。

OsMATL啟動子與其他真核啟動子相似, 包含了典型的基礎轉錄調控的順式作用元件(圖4), 有47個TATA-box和36個CAAT-box, 其中TATA-box主要集中在0至-1000 bp處, CAAT-box分散分布在啟動子區(qū)。還有 4種逆境響應元件, 分別為厭氧誘導的ARE元件、GC-motif元件、低溫脅迫相關的LTR元件和應激脅迫相關的 TC-rich repeats元件, 這些元件可能參與了植物防御。5種(8個)光響應元件, 如Box 4、G-box、MRE、TCT-motif和 TCCC-motif。此外還有4種(6個)激素響應元件、1種(2個)生理調控相關元件、1種(2個)蛋白結合位點相關元件和若干功能未知的順式作用元件。

2.2 CRISPR/Cas9靶點分析

為了獲得不同位點的OsMATL突變體, 在OsMATL基因編碼區(qū)設計3個單靶點(圖1), 第1外顯子上的靶點距陳紹江團隊報道的CRISPR/Cas9靶點下游11 bp, 較為徹底的破壞OsMATL的功能; 第3外顯子上的靶點在DGA/G motif處; 第4外顯子上的靶點距玉米天然突變位點上游8 bp處, 與先正達公司和王克劍團隊在第 4外顯子上的靶點接近, 此靶點能夠減少非預期的影響, 獲得具有單倍體誘導功能的突變體。在啟動子區(qū)域-1200 bp到-1500 bp設計雙靶點敲除多個順式作用元件, 2個靶點之間距離293 bp (圖1),預期獲得OsMATL基因表達量具有差異的等位突變。

2.3 OsMATL突變位點分析

所有轉化均成功獲得T0代轉基因苗, 對T0代轉基因苗進行測序, 篩選OsMATL編碼區(qū)純合突變的植株和OsMATL啟動子區(qū)大片段缺失的植株。OsMATL編碼區(qū)上一共獲得了 56種純合突變體(表2), 純合突變率為19%。在第1外顯子的靶點位置, 日本晴中獲得 4種純合突變, 分別為單堿基 A和 T的插入、8個堿基的缺失、3個堿基的替換和10個堿基的缺失; 華航48中只獲得了單堿基 A插入的純合突變。這些突變類型均導致了移碼突變,其中10個堿基的缺失使得翻譯在第112個氨基酸處提前終止, 截短了 303個氨基酸。對比蛋白質預測的結構(圖5), 發(fā)現(xiàn)第1外顯子上突變體的三級結構與野生型的完全不同, 蛋白結構更簡單。

表2 T0代編碼區(qū)純合突變及啟動子區(qū)大片段缺失突變類型Table 2 Homozygous mutation in coding region and large fragment deletion mutation in promoter region types of T0 generation

在第3外顯子靶點位置, 獲得了單堿基A和T的插入、單堿基和多個堿基缺失的純合突變。在日本晴中獲得6種類型的純合突變, 其中6個堿基和9個堿基的缺失導致該位點編碼氨基酸的缺失, 而其他突變類型均引起移碼突變, 使得DGA/G motif喪失, 蛋白翻譯出現(xiàn)不同程度的提前終止。對比蛋白質預測的結構(圖5), 第 3外顯子上突變體的蛋白結構較野生型簡單, 但比第1外顯子上突變體的蛋白結構復雜。

在第4外顯子靶點位置, 日本晴和華航48中均獲得了單堿基A和T的插入以及2個堿基缺失的純合突變。此外, 在日本晴中獲得了單個堿基缺失的純合突變, 華航 48中獲得了 20個堿基缺失的純合突變。這些突變類型均導致了移碼突變, 其中單個堿基的缺失導致翻譯在第378個氨基酸處提前終止, 其他的移碼突變均未導致翻譯提前終止。第4外顯子上的突變只有少量 C端氨基酸改變, 蛋白三級結構與野生型相似(圖5), 突變后的蛋白結構細微的差異可能導致催化位點的喪失, 使得蛋白失去了原有的功能。

啟動子區(qū)獲得了7種含有大片段缺失的突變體(表2), 占33.33%。主要為300 bp左右的大片段缺失, 敲除了多個順式作用元件, 分別為 3個TATA-box、2個CAAT-box、4個光響應元件和1個激素響應元件。 此外, 還有1個缺失722 bp的突變體, 刪除了多個TATA-box和多種順式作用元件。進一步對啟動子區(qū)大片段缺失突變體OsMATL基因進行實時熒光定量PCR分析(圖5-E), 結果顯示啟動子區(qū)域293 bp的缺失顯著降低了OsMATL基因表達量,該種類型的突變可能影響OsMATL基因的功能。

2.4 OsMATL突變體結實情況分析

對OsMATL突變體結實情況進行調查(圖6和圖7), 日本晴和華航48中OsMATL編碼區(qū)突變體結實率分別為 2.87%～6.92%和 12.46%～15.26%, 均極顯著低于野生型,OsMATL編碼區(qū)突變后對秈稻結實的影響比粳稻小, 暗示秈稻更能忍OsMATL基因的功能缺失。日本晴中OsMATL編碼區(qū)突變體敗育率極顯著增加, 高達 51%以上; 華航 48中OsMATL編碼區(qū)突變體敗育率為11%～18%, 其中第4外顯子上突變體敗育率極顯著高于野生型。在日本晴和華航48編碼區(qū)突變體的后代中均發(fā)現(xiàn)不同程度的敗育籽粒, 大部分只剩薄薄的種皮內部無內含物, 小部分胚乳出現(xiàn)不同程度的皺縮(圖7-C, D)。華航48啟動子區(qū)域大片段的缺失對植株的結實幾乎沒有影響,暗示OsMATL基因表達量的改變與編碼氨基酸的改變調控雙受精的機制可能不同。

3 討論

2017年, 控制玉米單倍體誘導的關鍵基因MTL幾乎同時被 3個國家的科學家獨立克隆, 單倍體誘導系該基因第4外顯子處發(fā)生了4 bp的插入, 引起氨基酸的移碼突變, 導致MTL蛋白被截短[7-9]。全長的MTL蛋白被定位在精細胞膜上, 而突變后截短的MTL蛋白在精細胞膜上并未觀察到信號,MTL基因可能參與信號轉導或配子融合的過程, 突變后MTL蛋白在精細胞膜上的缺失可能是單倍體誘導的原因[22]。利用基因編輯技術對玉米中的MTL基因進行突變, 證明了編碼磷脂酶的MTL基因功能減弱或者喪失能夠誘導單倍體的產生。Kelliher等[7]利用TALEN技術對玉米NP2222在自然突變位點附件進行編輯, 使得部分肽段缺失, 單倍體誘導率為6.7%。劉晨旭等[8,23]對ZmPLA1第1外顯子進行編輯,獲得單堿基A插入、單堿基缺失和11個堿基缺失的等位突變, 造成較為徹底的基因突變, 單倍體誘導率為2%左右與Stock 6誘導率基本一致, 胚乳敗育籽粒頻率也顯著升高, 證明了MTL基因突變會導致玉米胚乳敗育。隨后董樂等[10]利用CRISPR/Cas9技術對玉米自交系ZC01的MTL基因天然突變位點上游5 bp處進行靶向突變, 獲得了一系列的MTL突變體, 以雜交種ZY7、ZY8和單99為受體測定單倍體誘導率, 驗證了所獲得的突變體具有較高的單倍體誘導能力, 平均單倍體誘導率為 7.32%, 此研究結果與Kelliher等的結果相近, 推測MTL基因突變位點和材料可能會影響單倍體誘導率。

MTL在作物中功能保守, 為以單倍體誘導基因為基礎的單倍體誘導系統(tǒng)在其他作物中的建立提供了途徑。先正達公司率先在水稻中實現(xiàn)單倍體誘導,通過氨基酸同源序列比對在水稻中找到了MTL同源基因OsMATL, 對秈稻自交系IR58025B中OsMATL基因的第1外顯子和第4外顯子上天然突變位點下游7 bp處進行編輯, 突變體的結實率為20%, 單倍體誘導率2%～6%左右, 且單倍體誘導率受母本遺傳背景的影響, 與玉米MTL突變后結果相似, 證明了MTL在作物中功能保守[10-11]。王春等[12]對秈粳雜交稻春優(yōu)84中OsMATL基因第4外顯子上天然突變位點上游5 bp處進行編輯, 對單堿基C插入純合突變體以及單堿基C插入和單堿基缺失雙等位突變體進行分析, 突變體的結實率為11.5%, 單倍體誘導率為4.4%。劉晨旭等[13]將單倍體誘導系統(tǒng)擴展到六倍體小麥中, 利用 CRISPR/Cas9技術對小麥 CB037中TaPLA第1外顯子進行編輯, 成功獲得了小麥A、D基因組磷脂酶基因TaPLA的突變體, 該突變體結實率為 30%～60%, 可誘導產生約 5%～15%的單倍體,但同時在自交和雜交過程中還會產生大量的敗育籽粒和一定頻率的非整倍體籽粒。劉會云等[14]利用優(yōu)化的SpCas9系統(tǒng)對小麥Fielder和寧春4號的TaMTL基因設計雙靶點進行高效的編輯, 獲得了小麥A、B和D基因組3個TaMTL基因的突變體, T0代突變體結實率明顯降低, 三突結實率僅為19.8%～22.4%, T1代突變體單倍體誘導率可達到 18.9%, 并在后代中發(fā)現(xiàn)了胚缺失、胚和胚乳雙缺失的籽粒表型。利用CRISPR/Cas9技術對作物中單倍體誘導基因進行編輯可快速獲得單倍體誘導系, 至此單倍體誘導系統(tǒng)在三大糧食作物上均得以驗證。玉米、水稻和小麥中誘導基因突變后單倍體誘導率并不同, 單倍體誘導率可能與突變位點和遺傳背景有關, 在不同突變位點和遺傳背景的材料中可能存在一些單倍體誘導的修飾位點。本研究對粳稻日本晴和秈稻華航48兩個遺傳背景不同的材料中OsMATL第1外顯子、第3外顯子、第 4外顯子及啟動子進行不同位置的編輯, 獲得了不同位點和不同遺傳背景的OsMATL突變體。本研究中OsMATL編碼區(qū)的移碼突變, 使得氨基酸在不同位置開始發(fā)生改變以及蛋白翻譯提前終止, 導致蛋白結構發(fā)生不同程度的改變, 其中第1外顯子上突變后蛋白結構與劉晨旭[23]對玉米MTL基因第 1外顯子突變后蛋白結構變化相似, 突變后蛋白結構更簡單。蛋白結構不同程度的改變可能會影響OsMATL蛋白與細胞膜的結合能力, 從而誘導產生不同頻率的單倍體, 為在水稻中獲得高頻單倍體誘導系奠定了基礎。

單倍體誘導系在誘導單倍體的過程中會引起結實率的降低, 同時, 會產生較高頻率的敗育籽粒。本研究獲得的OsMATL編碼區(qū)純合突變體的結實率均顯著極降低, 首次對粳稻中OsMATL基因進行突變,發(fā)現(xiàn)粳稻OsMATL編碼區(qū)突變后對結實的影響比秈稻大, 粳稻對OsMATL基因缺失的耐受性較差。先正達公司[11]和王春等[12]對水稻中OsMATL基因進行突變后結實率為 10%～20%, 并可誘導產生 2%～6%的單倍體。本研究中秈稻突變體的結實率與前人研究結果相似, 可推測本研究中秈稻突變體的單倍體誘導率約為5%。本研究在水稻OsMATL突變體后代中發(fā)現(xiàn)了不同程度的敗育籽粒, 前人對玉米[7-9]和小麥[13-14]中MTL基因進行編輯后均伴隨著敗育籽粒的產生, 敗育與單倍體的形成密切相關[24], 說明MTL基因突變后在不同的作物中均發(fā)生了異常雙受精。OsMATL編碼區(qū)突變體結實率的降低和敗育籽粒的產生, 暗示本研究在秈稻和粳稻上獲得的OsMATL編碼區(qū)突變體均可能具有單倍體誘導的功能。OsMATL啟動子區(qū)域大片段的缺失對植株結實并沒有顯著影響, 啟動子大片段缺失的純合突變是否會造成結實率的降低需要進一步的研究。本研究篩選到不同突變位點和不同遺傳背景的OsMATL突變體,為水稻單倍體誘導系創(chuàng)制提供了基礎, 也為進一步研究OsMATL基因的功能提供了材料。

4 結論

以粳稻日本晴和秈稻華航48為研究材料, 本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得OsMATL移碼突變和啟動子大片段缺失的突變體,OsMATL編碼區(qū)突變極顯著降低了結實率, 但突變效應受到不同位點及遺傳背景的影響, 秈稻對于突變的忍受程度高于粳稻。此外,OsMATL啟動子區(qū)域大片段的缺失對植株的結實幾乎沒有影響, 暗示OsMATL基因表達量的改變與編碼氨基酸的改變調控雙受精的機制可能不同。