ACC處理對(duì)不同基因型玉米幼苗響應(yīng)氮素供給的調(diào)控效應(yīng)

吳冰卉 王桂萍 王玉斌 李召虎 張明才

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心 / 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 北京100193

玉米是重要的糧飼作物和工業(yè)原料, 目前已位列我國(guó)三大糧食作物的首位, 因此玉米豐產(chǎn)高效栽培對(duì)我國(guó)糧食安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[1]。氮素在玉米生長(zhǎng)發(fā)育中作用十分重要, 大量研究表明, 氮肥運(yùn)籌可以提高玉米的產(chǎn)量和氮肥利用率[2-4]。因此,研究玉米高效利用氮肥機(jī)制, 提高氮素的利用效率具有重要意義。玉米中氮素的利用效率受玉米生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中氮素的吸收、同化和再分配過(guò)程等的控制, 是許多生理生化反應(yīng)過(guò)程相互作用的結(jié)果[5-6]。不同基因型玉米品種的氮素吸收與轉(zhuǎn)移效率上存在著較大差異, 其中綠熟品種的氮素轉(zhuǎn)移效率較低,氮素利用效率較低[7-8]。乙烯作為一種常見(jiàn)的植物激素, 在植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)脅迫防御反應(yīng)中起重要調(diào)控作用, 且在植物吸收氮素過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[9]。在玉米生產(chǎn)中, 乙烯可調(diào)控玉米根系建成與株型, 有效解決了由高密、不合理氮肥施用以及品種特性等導(dǎo)致群體質(zhì)量下降引起倒伏、產(chǎn)量降低等問(wèn)題[10-11]。植株響應(yīng)不同氮素水平供給過(guò)程中乙烯信號(hào)也受到了調(diào)節(jié)[9]。研究表明, 外源添加ACC抑制了油菜根系伸長(zhǎng)與氮素吸收, 且在油菜生長(zhǎng)后期可調(diào)控植株氮素再利用能力[12-14]。在氮素充足的條件下, 乙烯利可以提高芥菜的氮素利用效率[15]。此外,乙烯利處理降低了夏玉米氮素吸收量和氮素吸收效率, 但提高了氮素利用效率和氮農(nóng)學(xué)效率, 并且乙烯利與氮肥在氮吸收量、氮吸收效率和氮農(nóng)學(xué)效率上有顯著的互作效應(yīng)[16]。但是, 玉米植株響應(yīng)氮素供給過(guò)程中, 乙烯調(diào)控植株生長(zhǎng)與氮素吸收機(jī)制缺乏研究?；谟衩自谟酌缙趯?duì)環(huán)境脅迫反應(yīng)敏感[17],本研究通過(guò)比較研究不同氮素水平下不同基因型玉米幼苗間氮素積累差異, 分析乙烯信號(hào)表達(dá)與氮素吸收的關(guān)系, 結(jié)合外源添加乙烯合成前體 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC), 分析乙烯對(duì)不同基因型玉米氮素吸收的調(diào)控效應(yīng)。研究結(jié)果將揭示乙烯對(duì)玉米氮素吸收的調(diào)控機(jī)制, 為乙烯在玉米生產(chǎn)中氮素高效利用中應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用鄭單958、瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào)3個(gè)玉米品種作為試驗(yàn)材料。RNA快速提取試劑盒購(gòu)買(mǎi)于艾德萊生物科技有限公司; 反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒; 熒光定量染料為 TaKaRa公司TB Green Reagerts。試驗(yàn)中使用的其他試劑是進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)光照培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行, 采用液體培養(yǎng)法。挑選大小均勻一致的玉米種子, 在室溫下用10%過(guò)氧化氫滅菌20 min, 用去離子水沖洗5遍后均勻播種在干凈濕潤(rùn)的石英沙中。當(dāng)玉米幼苗長(zhǎng)至一葉一心時(shí), 挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗, 去掉胚乳后轉(zhuǎn)移至半營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)液采用改良的 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。以 KNO3為氮源, 氮素水平設(shè)置低氮0.05 mmol L-1NO3-(low nitrogen level, LN)和正常氮2 mmol L-1NO3-(sufficient nitrogen level,SN)處理。在移苗2 d后進(jìn)行ACC處理。ACC處理的濃度為1 μmol L-1, 氮素處理的同時(shí)添加ACC。完全隨機(jī)排列, 每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換一次, 培養(yǎng)溫度為 28℃/22℃, 光照時(shí)間為 16 h, 濕度控制在大約70%～80%。

1.3 測(cè)定內(nèi)容與方法

1.3.1 干物質(zhì)積累量 在氮素處理以及 ACC處理后的第 7天, 在處理的每個(gè)組合中隨機(jī)挑選 8株幼苗, 用去離子水洗凈表面雜質(zhì)以及殘留的營(yíng)養(yǎng)液后吸干表面水分, 用剪刀將單株分為地上部和地下部。地上地下部分別裝入牛皮紙袋中, 放入105℃烘箱殺青20 min, 之后放入65℃烘箱烘干至恒重, 稱量記干重(g)。

1.3.2 全氮含量 將 1.3.1中烘干稱重完畢的樣品研磨粉碎過(guò)45目篩。樣品按照凱氏定氮法進(jìn)行全氮測(cè)定, 具體方法參考Bremner和Mulvaney[18]。樣品全氮含量(mg) = 樣品氮濃度(mg g-1)×樣品干重(g)。

1.3.3 葉綠素含量 取氮素處理 5 d后的葉片,剪碎后混勻, 用天平準(zhǔn)確稱取 0.2 g后放入液氮中,然后用提前預(yù)冷的 95%乙醇研磨, 用濾紙過(guò)濾到50 mL離心管, 定容至25 mL。取過(guò)濾后的溶液用紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)(665 nm和 649 nm)測(cè)量模式進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)測(cè)量的吸光值計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的濃度。Ca= 13.95A665-6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665;CT=Ca+Cb。

1.3.4 可溶性蛋白含量 取玉米幼苗氮素處理3 d后的新葉和胚根, 用去離子水沖洗后用吸水紙擦干, 用剪刀剪碎, 每個(gè)樣品取0.2 g, 每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù)。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行可溶性蛋白測(cè)量。

1.3.5 乙烯釋放速率 在ACC處理6 d后對(duì)玉米幼苗進(jìn)行取樣, 分別取不同處理下的玉米幼苗地上部和地下部分, 立即將其放入 8 mL青霉素小瓶中,然后在小瓶中放入去離子水浸泡過(guò)的濾紙保持濕潤(rùn),蓋上蓋子并用封口膜封住, 密閉室溫黑暗下放置2 h。然后取已抽真空的12 mL真空集氣瓶, 用排水法將青霉素小瓶中氣體全部收集。取出樣品并稱取鮮重。用Shimadzu GC-2010氣相色譜儀測(cè)定乙烯含量。乙烯釋放速率(nmol h-1g-1FW) =A×a×V÷T÷M, 其中,A為乙烯峰面積;a為乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率, 值為0.0236 nmol mL-1;V為容器體積(mL);T為密閉孵育時(shí)間(h);M為樣品鮮重(g)。

1.3.6 基因表達(dá)量測(cè)定 取玉米幼苗氮素與ACC處理 12 h后的根尖, 將樣品立即置于液氮中,后保存在-80℃冰箱中。采用艾德萊生物科技有限公司植物RNA快速提取試劑盒進(jìn)行玉米總RNA的提取, 置于-80℃冰箱中保存。采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物稀釋10倍作為模板 cDNA。使用 TaKaRa公司 TB Green Reagerts熒光染料, 采用ABI-7500 fast PCR儀進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。以ZmUbiquitin為內(nèi)參, 測(cè)定相關(guān)基因的表達(dá)量(表1)。反應(yīng)體系為15 μL, 含TB Green 7.5 μL, 正向和反向引物各 0.3 μL, ddH2O 5.1 μL, ROX Reference Dye II 0.3 μL, cDNA模板 1.5 μL。采用兩步法PCR反應(yīng)程序。根據(jù)樣品的特定熒光閾值下的 Ct值, 利用 2-ΔΔCt計(jì)算方法計(jì)算得到不同樣品的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與圖表制作, 處理后的數(shù)據(jù)采用R x64 3.6.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,圖中不同小寫(xiě)字母表示不同品種不同處理間差異達(dá)到顯著性水平(P≤ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACC處理對(duì)不同基因型玉米植株干物質(zhì)積累和根冠比的調(diào)控

LN處理抑制不同基因型玉米植株地下部和地上部干物質(zhì)的積累(圖1-A, B), 但鄭單 958無(wú)論在LN或SN條件下植株地上部和地下部生物量均高于德美亞3號(hào)和瑞福爾1號(hào)。而且, ACC處理抑制LN和 SN培養(yǎng)條件下不同基因型玉米植株地上與地下部干物質(zhì)積累。此外, 與SN比較, LN處理顯著增加了不同基因型玉米植株根冠比(圖1-C)。ACC處理均提高了LN或SN條件下不同基因型玉米植株根冠比。

2.2 ACC處理對(duì)不同基因型玉米植株氮素積累的調(diào)控

LN處理顯著降低不同基因型玉米植株地上和地下部氮素的積累, 而且德美亞 3號(hào)和瑞福爾 1號(hào)植株在LN和SN條件下的氮素積累量均顯著低于鄭單958 (圖2)。ACC處理顯著降低了LN和SN條件下不同基因型植株地上和地下部的氮素積累。

2.3 ACC處理對(duì)不同基因型玉米葉片可溶性蛋白和葉綠素含量的調(diào)控

與SN比較, LN處理顯著降低了不同基因型玉米植株葉片可溶性蛋白和葉綠素含量(圖3), 其中鄭單 958葉片中可溶性蛋白和葉綠素含量均顯著高于其他2個(gè)品種, 而且德美亞3號(hào)在LN條件下葉片葉綠素含量下降最大, 表明其比其他2個(gè)品種對(duì)氮素更為敏感。在SN條件下, ACC處理顯著促進(jìn)了各基因型葉片可溶性蛋白和葉綠素積累。與其相反, 在LN條件下, ACC處理顯著降低了各基因型葉片可溶性蛋白和葉綠素積累, 其中福爾 1號(hào)和德美亞 3號(hào)葉片可溶性蛋白和葉綠素含量降低幅度大于鄭單958。

2.4 ACC對(duì)不同基因型玉米植株乙烯釋放速率調(diào)控

與SN比較, LN處理顯著降低了不同基因型玉米植株葉片乙烯釋放量速率(圖4)。ACC處理顯著促進(jìn)LN和SN條件下不同基因型植株葉片乙烯釋速率,并且德美亞3號(hào)和瑞福爾1號(hào)植株受ACC處理調(diào)控影響較大。

2.5 ACC對(duì)不同基因型玉米植株乙烯合成限速酶表達(dá)的調(diào)控

與SN比較, LN處理顯著抑制不同基因型玉米植株根系中ZmACO15與ZmACS7的表達(dá)(圖5)。同時(shí), 在LN條件下, ACC處理促進(jìn)了不同基因型玉米植株根系中ZmACO15與ZmACS7的表達(dá), 相反, 在SN條件下, ACC處理抑制不同基因型玉米根中ZmACO15與ZmACS7的表達(dá)。另外, 在 LN或 SN條件下, 瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào)與鄭單958相比,根中ZmACO15與ZmACS7的表達(dá)較低。

2.6 ACC對(duì)不同基因型玉米植株硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的調(diào)控

LN處理顯著影響硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá), 其中LN處理顯著誘導(dǎo)ZmNRT2.1在不同基因型玉米根中的表達(dá), 但對(duì)ZmNRT1.1a表達(dá)影響較小(圖6)。與鄭單 958相比, 瑞福爾 1號(hào)和德美亞 3號(hào)根中ZmNRT2.1的表達(dá)受硝酸鹽誘導(dǎo)較小。在 LN條件下, ACC促進(jìn)不同基因型玉米根中ZmNRT2.1的表達(dá), 相反, 在 SN條件下, ACC抑制其根中ZmNRT2.1的表達(dá)。與ZmNRT2.1不同, 硝酸鹽與ACC處理對(duì)ZmNRT1.1a在不同基因型玉米根中的表達(dá)影響較小。

3 討論

3.1 ACC對(duì)不同基因型玉米幼苗響應(yīng)氮素供給過(guò)程中形態(tài)建成的調(diào)控

3個(gè)玉米品種在LN條件下第7天地上部和地下部干重明顯降低, 但根冠比增加。前人研究表明, 玉米植株響應(yīng)氮脅迫的典型反應(yīng)是通過(guò)增加根部表面積和減少地上部的生長(zhǎng)方式來(lái)提高同化物從地上部到地下部的轉(zhuǎn)運(yùn), 從而顯著增加根冠比[19]。ACC處理顯著降低 3個(gè)品種地上部和地下部的干重, 乙烯可以降低玉米株高, 這與表型是相符合的。與鄭單958相比, ACC處理7 d后, 瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào)在 LN條件下葉片先出現(xiàn)黃化早衰表型。這一結(jié)果表明鄭單958較瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào)耐低氮脅迫, 瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào)在LN條件下對(duì)乙烯更敏感。

3.2 乙烯對(duì)不同基因型玉米品種響應(yīng)低氮脅迫過(guò)程中氮素積累與生理生化指標(biāo)調(diào)控

外源添加ACC處理會(huì)顯著提高3個(gè)玉米品種在LN和SN下的葉片乙烯釋放量, 乙烯可以加速葉片衰老, 這與表型也是相一致的。葉綠素降解和蛋白質(zhì)含量的降低是植物衰老的典型特征。LN處理會(huì)顯著降低玉米幼苗地上部和地下部的氮素積累量、葉片葉綠素含量和可溶性蛋白含量。葉綠素的合成與氮的再利用和氮的同化相關(guān), 而且處在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的植物, 在氮脅迫的條件下會(huì)將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物由老葉向新葉轉(zhuǎn)移[20-21], 因此老葉葉片中的葉綠素含量在 LN條件下會(huì)降低。與瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào)相比, 鄭單958在LN條件下, 葉片葉綠素含量較高, 耐低氮脅迫, 這與表型相一致。外源添加ACC處理通過(guò)降低 LN下葉片葉綠素含量, 加速玉米葉片的衰老。但是在SN條件下添加ACC處理提高葉片中葉綠素含量, ACC處理抑制玉米生長(zhǎng), 提高單位葉面積內(nèi)葉綠素的含量。通過(guò)測(cè)定葉片可溶性蛋白含量發(fā)現(xiàn), LN處理顯著降低3個(gè)品種葉片可溶性蛋白的含量, 植物通過(guò)大量減少體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)來(lái)減少氮的消耗[20]。在LN條件下, 鄭單958葉片可溶性蛋白含量顯著高于瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào), 這與鄭單958較其他2個(gè)品種耐低氮的表型相一致。外源添加ACC處理通過(guò)降低葉片中可溶性蛋白含量加快玉米葉片的衰老。ACC處理顯著升高3個(gè)品種地上部氮濃度, 但會(huì)降低地上部和地下部的全氮含量, 氮濃度升高但含量降低, 這與ACC處理顯著降低植株干重有關(guān)。

3.3 乙烯對(duì)不同基因型玉米品種響應(yīng)氮素脅迫過(guò)程乙烯合成關(guān)鍵基因及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)調(diào)控

高等植物中存在 2種硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng), 即高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(high affinity transport system, HATS)和低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(low affinity transport system,LATS)[22-23]。NRT2.1是 NRT2家族中負(fù)責(zé)高親和硝酸鹽吸收最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體, 在大多數(shù)情況下發(fā)揮吸收NO3-的功能。AtNRT2.1缺失突變體atnrt2.1中, 高親和硝酸鹽吸收活性顯著降低[24]。小麥TaNRT2.1和黃瓜CrNRT2.1同樣具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能[25-26]。ZmNRT2.1與玉米表皮吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)高親和力硝酸鹽這一過(guò)程有關(guān)[27]。乙烯通過(guò)調(diào)控AtNRT1.1或AtNRT2.1的表達(dá)影響根系發(fā)育與氮素吸收, 如乙烯信號(hào)突變體etr1-3和ein2-1中AtNRT1和AtNRT2.1的表達(dá)對(duì)氮素敏感性降低, 且乙烯負(fù)調(diào)控AtNRT2.1的表達(dá), 減少高親和 NO3-吸收[28-29]。ACO 和 ACS作為乙烯合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶, 其基因表達(dá)量影響著植物產(chǎn)生乙烯水平。乙烯的合成主要由ACS調(diào)控, 同時(shí)ACO對(duì)乙烯的合成也起著調(diào)控作用, 乙烯處理導(dǎo)致乙烯合成增加[30]。前人研究發(fā)現(xiàn)植物在遇到環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)下調(diào)或上調(diào) ACS基因的表達(dá)[31],當(dāng)在一些植物中添加乙烯合成前體 ACC, 也可以觀察到乙烯的產(chǎn)生明顯增加[32]。我們研究發(fā)現(xiàn), LN處理顯著抑制 3個(gè)玉米品種根中ZmACS7和ZmACO15的表達(dá), 抑制根系乙烯的釋放, 外源添加ACC處理促進(jìn)LN條件下3個(gè)品種根中ZmACS7和ZmACO15的表達(dá), 促進(jìn)乙烯的釋放。因此我們推測(cè), ACC處理是否也可以通過(guò)調(diào)控玉米硝酸鹽ZmNRT2.1和ZmNRT1.1的表達(dá)影響根系氮素吸收？通過(guò)測(cè)定玉米硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn),LN處理顯著抑制3個(gè)玉米品種根中ZmNRT2.1的表達(dá), 鄭單958根中ZmNRT2.1表達(dá)顯著高于瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào), 這一結(jié)果與低氮下鄭單958較瑞福爾 1號(hào)和德美亞 3號(hào)耐低氮脅迫表型相一致。ACC處理促進(jìn)LN下3個(gè)品種根中ZmNRT2.1的表達(dá), 而且, 與瑞福爾 1號(hào)和德美亞 3號(hào)相比,ACC處理對(duì)LN條件下鄭單958根中ZmNRT2.1誘導(dǎo)較高, 這一結(jié)果與外源添加ACC促進(jìn)LN下瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào)葉片早衰結(jié)果相一致。在LN下, 乙烯可能通過(guò)反饋調(diào)節(jié)ZmNRT2.1的表達(dá), 促進(jìn)根系硝酸鹽的吸收, 延緩玉米葉片的衰老。與NRT2.1不同,NRT1.1在擬南芥中為雙親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。玉米中與AtNRT1.1同源的基因有 4個(gè),ZmNRT1.1a具有吸收硝酸鹽功能, 且表達(dá)不受硝酸鹽的調(diào)控[28]。我們研究發(fā)現(xiàn), 硝酸鹽與 ACC處理對(duì)ZmNRT1.1a在 3個(gè)品種玉米根中的表達(dá)影響較小。以上結(jié)果表明, LN處理可能通過(guò)抑制乙烯合成,乙烯通過(guò)調(diào)控ZmNRT2.1表達(dá)影響不同基因型玉米品種響應(yīng)氮素過(guò)程中葉片的衰老。

4 結(jié)論

在LN條件下, 與鄭單958相比, 瑞福爾1號(hào)和德美亞 3號(hào)對(duì)氮素脅迫反應(yīng)更迅速, 早衰表型更明顯。外源添加ACC處理通過(guò)降低LN條件下葉片全氮含量、葉綠素含量以及可溶性蛋白含量加快瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào)早衰表型。LN處理顯著抑制玉米根系乙烯合成關(guān)鍵酶ZmACS7和ZmACO15表達(dá),降低乙烯含量, 外源添加 ACC處理促進(jìn) LN下ZmACS7和ZmACO15表達(dá), 促進(jìn)乙烯合成。乙烯參與調(diào)控ZmNRT2.1的表達(dá)影響氮素吸收, LN條件下,鄭單958根系中ZmNRT2.1的表達(dá)量顯著高于瑞福爾1號(hào)和德美亞3號(hào), 從而促進(jìn)氮素吸收, 延緩葉片衰老。LN條件下, ACC處理加速玉米葉片的衰老并調(diào)節(jié)了乙烯合成, 進(jìn)而調(diào)控ZmNRT2.1的表達(dá)調(diào)控氮素吸收。