1 株H7N9 亞型禽流感病毒的遺傳進化和分子特征分析

郭康康，崔 歡，張 誠，張 博，陳立功，劉聚祥，董世山

（1.河北農業(yè)大學 動物醫(yī)學院, 河北 保定 071001；2. 農業(yè)部動物疫病病原生物學華北科學觀測實驗站， 河北 保定 071001；3. 河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心，河北 保定 071001）

H7N9 亞型禽流感病毒（Avain influenza virus，AIV）是由8 個基因片段組成的單鏈負股RNA 病毒［1］。根據(jù)致病性的高低，可分為高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic AIV，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（Low pathogenic AIV，LPAIV），血凝素（Hemagglutinin，HA）是AIV 粒子表面最豐富的蛋白， 是影響病毒致病力和宿主范圍的主要因素， 可以介導病毒和宿主細胞受體的結合［2］。野禽被認為是AIV 的天然宿主，當LPAIV 由野禽傳播到家禽時， 在HA 中引入多個堿性氨基酸殘基發(fā)生變異， 轉化為HPAIV［3］。近年來研究證明AIV 的聚合酶B2（Polymerase B2，PB2）、聚合酶B1（Polymerase B1， PB1）和聚合酶A（Polymerase A，PA）蛋白發(fā)生適應性位點突變是AIV 跨物種傳播并適應新宿主的一種重要方式，其中PB2 蛋白上關鍵氨基酸位點突變是影響病毒致病性的重要因素，涉及到的位點如：E627K、E158G、A558V、D701N 等［4］。隨著研究的深入，AIV 中越來越多的蛋白適應性位點被發(fā)現(xiàn)，為研究預防和治療禽流感藥物提供了技術保障。

1997 年，我國香港首次報道了H5N1 AIV 感染人的事件，隨后H9N2、H7N3 等感染人的事件陸續(xù)發(fā)生［5］。2013 年，在我國上海出現(xiàn)首例人感染H7N9 案例，隨后安徽、江蘇、浙江等省份相繼發(fā)生， 養(yǎng)禽業(yè)也發(fā)生感染H7N9 亞型禽流感案例，不僅給我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，也對人類公共衛(wèi)生安全帶來前所未有的挑戰(zhàn)［6］。人群中散發(fā)性的出現(xiàn)H7N9 亞型禽流感感染事件，大多具有家禽或者活禽交易市場暴露史，為H7N9 AIV 從禽類直接跨物種傳染給人類提供了重要的潛在可能。

本研究通過對1 株H7N9 亞型禽流感病毒基因測序和序列分析，研究AIV 遺傳進化規(guī)律，了解其內部蛋白氨基酸位點變化，為禽流感防控提供了可靠依據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要試劑

RNA 提 取 試 劑 盒（RNeasy Micro Kit）購 自QIAGEN 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Magen 公司；反轉錄酶及其Buffer、dNTP、RNA 酶抑制劑、ExTaq 聚合酶及其Buffer、DL-2000 Marker 購自 TaKaRa 公司；隨機引物，反轉錄引物，流感通用擴增引物由工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組片段的擴增 嚴格按照QIAGEN 公司的RNA 提取試劑盒說明提取RNA。以病毒RNA 為模板，參照寶生物相關試劑盒說明書配制體系為20 μL，反轉錄合成cDNA。以病毒cDNA 為模板，用流感通用引物擴增8 個基因片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司測定基因序列。

1.2.2 基因序列分析 將禽流感8 個基因片段PB1、PB2、PA、HA、NA、 非 結 構 蛋 白（Nonstructural Protein，NS）、基質蛋白（Matrix Protein， M）、核蛋白（Nucleoprotein，NP）序列分別在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）進行核苷酸序列Blast 分析。從全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織（Global Initiative on Sharing All influenza Data， GISAID） 數(shù) 據(jù) 庫下載人源H7N9 病毒HA、NA 序列。使用MEGA 6. 0 軟件，進行系統(tǒng)進化分析。用NetNGlyc 1.0 Server 進行序列氨基酸位點分析。其中，人源流感 參 考 毒 株 為A/Wuxi/3/2013（H7N9）， ID 為EPI_ISL_153008。禽源流感參考毒株為A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）， 基 因PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M、NS 的GenBank 登錄號 分 別 為KJ549783.1、KJ549784.1、KJ549785.1、K J 5 4 9 7 8 7.1、K J 5 4 9 7 8 6.1、K J 5 4 9 7 8 8.1、KJ549789.1、KJ549790.1、KJ549787.1、KJ549786.1、KJ549788.1、KJ549789.1、KJ549790.1。

2 結果與分析

2.1 禽流感病毒基因組片段的擴增

通過RT-PCR 方法擴增1 株AIV 的8 個基因片段（圖1），測序得到8 個基因組序列。將序列在NCBI 上進行Blast 分析，確定為H7N9 亞型禽流感病毒并命名為A/environment/Hebei/621/2017（H7N9），簡稱EN621。

2.2 同源性分析

EN621 毒株8 個基因序列經(jīng)NCBI 中Blast 分析，結果顯示該病毒8 個基因片段均與H7N9 亞型禽流感病毒高度同源，相似度均在99% 以上（見表1）。

圖1 EN621 毒株8 個基因片段的擴增結果Fig. 1 PCR products of eight genes of EN621

表1 EN621 毒株8 個基因片段核苷酸同源性分析Table 1 Nucleotide homology analysis of eight genes of EN621

2.3 HA 和NA 遺傳進化分析

根據(jù)HA 和NA 遺傳進化分析（見圖2），其中與EN621 毒株HA 基因同源性最高的毒株是A/chicken/Henan/HNXY1/2017（H7N9），同源率為99.69%， EN621 毒株HA 基因與A/chicken/Guangdong/SD103/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/GD15/2016（H7N9）、A/chicken/Guangdong/HP001/2017（H7N9）、A/chicken/Jiangsu/19757/2015（H7N9） 和A/chicken/Jiangsu/18828/2014（H7N9）等珠江三角洲地域毒株屬于同一進化支進化而來。EN621 毒株HA 基因與人源流感毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）、A/Jiangsu/18828/2014（H7N9）、A/Jiangsu/19757/2015（H7N9） 同 源 率 分 別 為97.12%、97.36% 和97.42%。

EN621 毒株NA 基因同源率最高的毒株是A/chicken/Guangdong/S11523/2017（H7N9），同源率為99.71%， EN621 毒株NA 基因與A/chicken/Guangdong/SD156/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/SD11523/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/SD010/2017（H7N9）、A/Jiangsu/19758/2015（H7N9）、A/Jiangsu/60466/2016（H7N9）等珠江三角洲地域毒株屬于同一進化支進化而來。EN621 毒株NA 基因與人源流感毒株A/Jiangsu/19758/2015（H7N9）、A/Jiangsu/60466/2016（H7N9）、A/Jiangsu/03/2013（H7N9）、A/Nanjing/M2/2013（H7N9）同源率分別為98.38%、96.84%、97.28%、97.92%。結果顯示，EN621 可能來源于珠江三角洲譜系，屬于歐亞型；其HA 和NA 均與2013 年至2016 年人源H7N9 相對應片段相似度較高，推測其傳播宿主由禽傳播到人后再傳播到禽，進一步在禽內傳播。

圖2 HA、NA 基因進化樹Fig. 2 Evolutionary tree of HA, NA genes

2.4 HA 和NA 蛋白的相關糖基化位點分析

HA 蛋白氨基酸序列分析結果表明，共計編碼564 個氨基酸， 具有5 個潛在糖基化位點，其中與人源參考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的HA 蛋白和禽源參考毒株A/chicken/Shanghai/PDCN-02/2014（H7N9）的HA 蛋白對比發(fā)現(xiàn)。EN621 毒株的HA 蛋白的裂解位點處有多個連續(xù)堿性氨基酸 PKRKRTARGLF，符合典型高致病性AIV 分子特征， HA 受體結合位點226 位為谷氨酰胺（Q）未發(fā)生突變，優(yōu)先與禽類的特異性受體結合（見表2）。

表2 HA 蛋白糖基化位點分析Table 2 Analysis of glycosylation sites of HA proteins

NA 蛋白氨基酸序列分析結果表明，共計編碼465 個氨基酸，具有6 個潛在糖基化位點，其中與人源參考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的NA 蛋白和禽源參考毒株A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）NA 蛋白對比發(fā)現(xiàn)，EN621 毒株NA 蛋白上與耐藥性有關的關鍵氨基酸位點119E、152R、274H、292R、294N 未突變，不產生耐藥性（見表3）。

表3 NA 蛋白糖基化位點分析Table 3 Analysis of glycosylation sites of NA proteins

2.5 內部蛋白關鍵氨基酸位點分析

EN621 毒株內部蛋白與人源參考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的內部蛋白和禽源參考毒株A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）內部蛋白對比發(fā)現(xiàn)， EN621 毒株PA 蛋白上對小鼠致病性有影響以及對細胞生長和病毒復制有關的關鍵氨基酸224S、615K、638R、638R 和539K 等均未突變。EN621 毒株PB2 蛋白上對病毒的復制、致病性或跨宿主傳播能力等起決定性作用關鍵氨基酸627E、701D、714S、591Q、590G、158E 等均未突變。EN621 毒株PB1 蛋白上對影響聚合酶活性的關鍵氨基酸677T 和678S 未發(fā)生突變。EN621 毒株NP 蛋白上對AIV 的復制和致病性有著密切聯(lián)系的關鍵氨基酸第184 位由A 突變?yōu)镵。EN621 毒株NS1 蛋白與耐藥性相關的位點92D 未發(fā)生突變。

3 討論與結論

根據(jù)HA 和NA 基因的遺傳進化樹分析顯示， 本研究中的H7N9 AIV 與2013 年無錫分離到的人源流感毒株相近， 推測可能為2013 年人源流感毒株與其他亞型禽流感毒株重組進化而來，在禽群中傳播。近年來研究表明AIV 在家禽和野生禽類體內不斷重組，使其具有高致病性和傳播性的潛在可能［7-8］。M、PB1、PB2 基因與H9N2 亞型禽流感毒株相應基因片段高度同源，同時M 基因與湖北、廣東、江蘇等南方地區(qū)分離的H9N2 AIV 的M 基因處于同一進化支，NP 基因與H6N6，H9N2 等多個亞型禽流感毒株NP 基因高度同源，且宿主來源廣泛， 地域上多為長江和珠江三角洲地區(qū)，說明EN621 毒株是家禽和野生水禽等不同宿主來源的基因重組進化而來， 珠江三角洲和長江三角洲兩地域是禽流感病毒的重組和傳播的重要場所，推測有可能起源于珠江三角洲［9-10］。遺傳進化分析結果表明本研究毒株并未發(fā)生較大變異，當前疫苗依舊可以預防，但仍要注意生物安全，防患于未然。

已報道的研究證實，PB2 蛋白上某些氨基酸的改變是影響AIV 致病性的重要因素，如PB2 蛋白中第627 位氨基酸由E 突變?yōu)镵，是最常見的哺乳動物適應性位點突變，且該位點在H10N8、H7N9、H3N2 等多種亞型AIV 中可檢測到，EN621 毒株PB2 蛋白的627 位氨基酸為E 未發(fā)生突變［11-14］。近年報道H9N2 禽流感病毒的PB2 的D253N 突變， 可增強對小鼠的致病性，而EN621 毒株PB2 蛋白D253N 未突變［15-16］。EN621 毒株NP 蛋白關鍵氨基酸位點第184 位由A 突變?yōu)镵，有報道稱此位點突變與AIV 的復制和致病性有著密切聯(lián)系，EN621 毒株PA 蛋白上影響聚合酶活性的510H 未突變［17］。有學者研究發(fā)現(xiàn)，NS1 蛋白的D92E 位點突變會造成流感病毒對人的致病性增強，也會對細胞因子如 IFN 的抗病毒耐藥性產生影響但本研究中的EN621 毒株NS1 蛋白的92D 未突變［17-18］。

本研究中的H7N9 AIV 為高致病性歐亞型禽流感毒株，HA 和NA 基因片段與人源流感毒株同源性較高，NP、M、PB1 等基因與多個亞型禽流感毒株高度同源，具有感染人的潛在可能，建議加強對H7N9 AIV 的監(jiān)測，并對家禽做好相應的免疫計劃，建立長期有效的防控機制。