新型異噁唑胺類除草活性分子的設計、合成 及活性研究

王彥恩，劉曉鳳，王紅雨，高玉潔，張金林

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學 理學院，河北 保定 071001；2. 河北農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，河北 保定 071001）

近年來，由于相同作用機理除草劑的長期大量使用，導致雜草抗藥性迅速發(fā)展［1］，據(jù)統(tǒng)計至少256種雜草對不同作用靶標的除草劑產(chǎn)生了抗性［2］，雜草抗性導致除草劑藥效降低和使用量增大，造成惡性循環(huán)，已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面臨的主要問題之一［3-4］，有效解決雜草抗性問題是新除草劑創(chuàng)制亟待解決的難題之一。

目前，基于已知除草作用靶標酶進行合理設計，是新農(nóng)藥分子的合理設計的有效手段。但是，長期大量使用單一靶標的除草劑，必然增大雜草的抗性風險，若輪換使用靶標相似的除草劑，抗性問題會變得更嚴重［5-6］。因此，新除草作用靶標的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新作用機制的除草劑分子奠定了重要基礎［7-8］，也將為雜草抗性治理提供有效的方法。

轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase）是植物體內(nèi)碳代謝和卡爾文循環(huán)中的重要酶蛋白，是植物光合速率的最大限制因子［10-11］，在光合作用中發(fā)揮著重要作用。趙斌等研究證實轉(zhuǎn)酮醇酶為除草活性分子α-三聯(lián)噻吩的作用靶標之一，進一步明確了轉(zhuǎn)酮醇酶可能是一種新的除草劑作用靶標［9］。目前玉米植物的轉(zhuǎn)酮醇酶晶體結構已有報道［12］，但是，以轉(zhuǎn)酮醇酶為靶標的除草劑開發(fā)還較為少見［13-14］。α-三聯(lián)噻吩是其潛在的抑制劑被廣泛研究，作為黃頂菊根系分泌物的分離提取產(chǎn)物，對馬唐和狗尾草等具有較強的除草活性。因此，對α-三聯(lián)噻吩進行結構改造，設計合成新型轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑，對解決雜草抗性具有重要研究意義。

基于生物電子等排取代或活性亞結構拼接方法是新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要方法。例如，磺酰脲類除草劑就是將磺酰胺、脲和三嗪胺三類除草劑的活性亞結構有機拼接創(chuàng)制而來［15-16］。雜環(huán)化合物尤其是含氮雜環(huán)化合物，具有高效、低毒、選擇性好等優(yōu)點［17-23］，例如，異噁唑類衍生物具有良好抗菌、殺蟲、除草等生物活性［17］，商品化除草劑異噁隆對馬唐和狗尾草等具有選擇性除草活性。

本研究基于新靶標轉(zhuǎn)酮醇酶，根據(jù)農(nóng)藥分子合理設計原理，對α-三聯(lián)噻吩進行先導優(yōu)化，將具有良好生物活性的藥效團引入化合物，設計合成9個新型異噁唑胺類化合物5(a-i)，并進行除草活性測試，從而為開發(fā)基于轉(zhuǎn)酮醇酶新靶標的除草劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試雜草種子為反枝莧（Amaranthus retroflexus）和馬唐（Digitaria sanguinalis）均由河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院農(nóng)藥系提供。

BRUKER AC-P400（400 MHz）核 磁 共 振 儀（CDCl3或DMSO-d6為 溶 劑，TMS 為 內(nèi) 標）；Agilent G6300 離子阱液相質(zhì)譜聯(lián)用儀；X-4 精密顯微熔點測定儀（北京富凱儀器有限公司），溫度計未經(jīng)矯正；HERAEUS（CHON, rapid） 型元素分析儀；層析用硅膠（200 ～300 目）為青島海洋化工廠。試驗過程中所用其他化學試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 目標化合物的合成

目標化合物的合成如（圖1）所示，室溫條件下，在水和甲醇混合溶劑中，芳（雜）環(huán)甲醛1 與鹽酸羥胺發(fā)生醛胺縮合生成芳（雜）環(huán)醛肟2，然后，2與NCS 發(fā)生取代反應生成氯代芳（雜）環(huán)醛肟3，在冰浴的條件下，化合物3 與芳（雜）環(huán)基乙腈4反應生成異噁唑胺化合物5(a-i)。具體合成步驟如下：

圖1 目標化合物的合成路線Fig. 1 Synthesis route of the target compounds

1.2.1 芳（雜）環(huán)醛肟2 的合成 在100 mL 圓底燒瓶中，加入15 mL 水、5 mL 甲醇、10.67 mmol芳（雜）環(huán)甲醛，室溫攪拌，依次向混合溶液中緩慢加入 1.112 g 鹽酸羥胺和 0.847 9 g 碳酸鈉，TCL監(jiān)測反應。反應結束后，用80 mL 二氯甲烷萃取，有機相用50 mL 飽和食鹽水洗滌、分離有機相，無水硫酸鈉干燥，抽濾、脫溶，真空干燥，得到芳（雜）環(huán)醛肟2。

1.2.2 氯代芳（雜）環(huán)醛肟3 的合成 在100 mL 圓底燒瓶中，加入適量的二氯甲烷溶解5.983 mmol 芳（雜）環(huán)醛肟2，室溫攪拌下，緩慢加入0.958 8 g NCS（N-氯代丁二酰亞胺），TLC 監(jiān)測反應進程，約6 h 后反應結束、降溫，用乙醚（50 mL×3）萃取、有機相依次用飽和食鹽水和50 mL 2%的稀鹽酸洗滌，分離有機相，無水硫酸鈉干燥，抽濾、脫溶，粗產(chǎn)品為氯代的芳（雜）環(huán)醛肟3。1.2.3 異噁唑胺化合物5 的合成 在100 mL 的圓底燒瓶中，依次加入3.556 mmol 氯代芳（雜）環(huán)醛肟3、5 mL 四氫呋喃、0.74 mL 三乙胺，然后在冰浴的條件下，繼續(xù)加入3.556 mol 呋喃甲酰乙腈（或噻吩甲酰乙腈、2-苯并咪唑基乙腈），TLC 跟蹤監(jiān)測反應進程，反應約5 h，減壓旋蒸溶劑，用二氯甲烷（50 mL×3）萃取、有機相用50 mL 飽和食鹽水洗滌，分離有機相，無水硫酸鈉干燥，抽濾、脫溶，粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為二氯甲烷和乙酸乙酯（20∶1 ～50∶1），即為異噁唑胺化合物5。

1.3 除草活性測定

采用小杯法和莖葉噴霧法測試化合物的生物活性，馬唐和反枝莧為供試植株。以DMF 為溶劑，分別將目標化合物5(a-i)和丙炔氟草胺（陽性對照）配成濃度為20 g/L 的供試物儲備液。取0.01 mL 的供試物儲備液用滅菌水稀釋至1 mL，配成濃度為200 mg/L 的待測溶液。以不含藥劑的空白溶液作為空白對照。

1.3.1 采用小杯法測試化合物的除草活性 將待測的雜草種子置于25 ℃培養(yǎng)箱中催芽至露白，選取大小一致的種子10 顆置于裝有1 層玻璃珠和1 層圓形濾紙片的小燒杯中。移取1 mL 供試物溶液或空白對照溶液緩緩加入到小燒杯中，用保濕膜覆蓋小燒杯并在保濕膜上隨機扎孔，以保證透氣性。將小燒杯置于24 ～26 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d 后，測定供試植株的根長和莖長，評價目標化合物對供試植株的抑制活性。

1.3.2 采用莖葉噴霧法測試化合物的除草活性 溫室條件下，在直徑為10 cm 和深度為20 cm 的塑料花盆中加入18 cm 的蛭石，從花盆底部澆水，至蛭石完全浸濕，然后在每個花盆中加入20 粒雜草種子，用蛭石覆蓋雜草種子，置于人工氣候箱進行培養(yǎng)。待雜草生長至2 ～3 片葉時，使用噴霧塔噴灑配制好的待測藥劑，測試化合物為5(a-i)及商品化除草劑丙炔氟草胺，施藥量為90 g/hm2。7 d 后，測定供試植株的鮮重，評價目標化合物對供試植株的抑制活性。

2 結果與分析

2.1 目標化合物結構表征

本試驗基于除草劑新靶標轉(zhuǎn)酮醇酶，根據(jù)農(nóng)藥分子合理設計原理，設計合成9 個異噁唑胺類化合物5(a-i)（表1），所有化合物均經(jīng)1H NMR 和元素分析驗證，其理化數(shù)據(jù)和結構表征如下：

化合物5a，淡黃色固體，產(chǎn)率81.5%，m.p.: 152.3 ～153.3 ℃；1HNMR(CD3Cl，400 MHz)δ7.78(s，1H)，7.37(d，J=4.0Hz，1H)，7.24(d，J=4.0 Hz，1H)，6.71 ～6.69(m，1H)，6.24(d，J=4.0 Hz，1H)，2.46(s，3H).Anal.calcd for C13H10N2O4:C60.47，H 3.90，N10.85；found C 60.44，H 3.85，N 10.81。

化 合 物5b， 黃 色 固 體， 產(chǎn) 率82.3%，m.p.: 129.1 ～130.1 ℃；1H NMR(CD3Cl，400 MHz)δ 8.03(d，J=4.0 Hz，1H)，7.72(d，J=4.0Hz，1H)，7.27 (t，J =4.0 Hz，1H)，7.20 (d，J = 4.0 Hz，1H)，6.22 (d，J= 4.0 Hz，1H)，2.44 (s，3H).Anal.calcd for C13H10N2O3S：C 56.92，H 3.67，N 10.21；found C 56.89，H 3.71，N 10.23。

化 合 物5c， 白 色 固 體， 產(chǎn) 率77.5%，m.p.: 124.2 ～134.2 ℃；1H NMR (CD3Cl，400 MHz)δ7.82 (d，J=8.0 Hz，1H)，7.35 ～7.27(m，3H)，6.33 (d，J=4.0 Hz，1H)，6.09 (d，J=4.0 Hz，1H)，2.37 (s，3H).Anal. calcd for C15H12N4O2：C 64.28，H 4.32，N 19.99；found C 64.25.89，H 4.35，N 19.94。

化 合 物5 d， 白 色 固 體， 產(chǎn) 率80.5%，m.p.: 134.5 ～135.5 ℃；1H NMR(CD3Cl，400 MHz)δ8.58(d，J=1.6 Hz，1H)，7.93 ～7.75 (m，4 H)，6.65 (d，J=4.0 Hz，1H). Anal. calcd for C12H8N2O3S: C 55.38，H 3.10，N 10.76；found C 55.35.89，H 3.09，N 10.70。

化合物5e，白色固體，產(chǎn)率82.5%，m.p.：129.5 ～130.5 ℃；1H NMR(CD3Cl，400 MHz)δ8.50 (s，1H)，8.32 (d，J=4.0 Hz，1H)，7.92～7.76 (m，3H)，7.21(t，J=4.0 Hz，1H).Anal. calcd for C12H8N2O2S2：C 52.16，H 2.92，N 10.14；found C 52.15，H 2.89，N 10.16。

化 合 物5f， 白 色 固 體， 產(chǎn) 率76.5%，m.p.: 108.5 ～109.5 ℃；1H NMR (CD3Cl，400 MHz)δ8.66(s， 1H )，7.77 ～7.63 (m， 4H)，7.34 ～7.31 (m，2H)，7.22 (t，J=4.0 Hz，1H ).Anal.calcd for C14H10N4OS: C 59.56，H 3.57，N 19.85；found C 59.55，H 3.59，N 19.84。

化 合 物5g， 白 色 固 體， 產(chǎn) 率77.1%，m.p.: 127.3 ～128.3 ℃；1H NMR (CD3Cl， 400 MHz)δ8.15 ～8.11(m， 2H)，7.75 (d，J=4.0 Hz， 1H)，7.60 (d，J=4.0 Hz，1H)，7.28 (t， J = 4.0 Hz，1H ). Anal. calcd for C11H7N3O2S2: C 47.64，H 2.54，N 15.15；found C 47.63，H 2.56，N 15.14。

化 合 物5h， 白 色 固 體， 產(chǎn) 率75.6%，m.p.: 119.5 ～120.5 ℃；1H NMR (CD3Cl，400 MHz)δ8.01 ～7.78 (m，2H)，7.42 (d，J = 3.6 Hz，1H)， 7.60 ～7.59 (m， 1H)，6.72 (t，J = 2.0 Hz，1H )，4.00 (s，3H). Anal. calcd for C12H10N4O3: C 55.81，H 3.90， N 21.70；found C 55.79，H 3.93，N 21.73。

化 合 物5i， 白 色 固 體， 產(chǎn) 率76.1%，m.p.: 123.4 ～133.4 ℃；1H NMR(CD3Cl， 400 MHz)δ8.09 (d，J=3.2 Hz，1H)，7.77 (d，J =4.4 Hz，1H)，7.61～7.59 (m，1H)，7.30 (t，J=4.0 Hz，1H )，7.27 ～7.25 (m，1H)，4.02 (s，1H). Anal. calcd for C12H10N4O2S: C 52.54，H 3.67，N 20.43；found C 52.53，H 3.69，N 20.45。

2.2 目標化合物的除草活性測定

2.2.1 小杯測試法 評價目標化合物5(a-i)的除草活性，以商品化除草劑丙炔氟草胺為陽性對照，小杯法測試化合物除草活性結果如表1 所示，在濃度為200 mg/L 時，大部分化合物對馬唐和反枝莧的根莖抑制率都大于80%，表明合成的化合物對馬唐和反枝莧有較好的防治效果；其中化合物5c 和5f 對馬唐和反枝莧的根莖抑制率均大于90%，其明顯優(yōu)于對照藥劑丙炔氟草胺對馬唐和反枝莧的根莖抑制作用（表1），說明5c 和5f 比對照藥劑的丙炔氟草胺具有更好的防治效果，與其它化合物不同，5c 和5f 都含有苯并咪唑基團，這可能是它們具有更高除草活性原因。

表1 化合物5(a-i)的結構和除草活性（200 mg/L，小杯法，抑制率%）Table 1 Structure and herbicidal activity of compounds 5(a-i) at 200 mg/L (small cup method, inhibition rate%)

2.2.2 莖葉噴霧法測試 在溫室條件下，莖葉噴霧法測試化合物5(a-i)及商品化除草劑丙炔氟草胺的苗后除草活性，施藥量為90 g /hm2，測試結果如表2 所示，大部分化合物對馬唐和反枝莧的鮮重抑制率大于80%，說明此類化合物具有一定的苗后除草活性；其中化合物5c 和5f 對馬唐和反枝莧鮮重抑制率大于90%，其明顯優(yōu)于對照藥劑丙炔氟草胺對馬唐和反枝莧的鮮重抑制率，具有更高效除草活性，這與小杯法測試結果基本一致。此外，與小杯法測試結果不同的是，化合物5h 和5i 也具有相對較好的苗后除草活性，它們對馬唐和反枝莧鮮重抑制率達到了90%左右，與其他化合物比較，5h 和5i 具有較低的疏水常數(shù)（CLogP），這可能會提高化合物的苗后除草活性。

表2 化合物5（a-i）的苗后除草活性（90 g /hm2，莖葉噴霧法，抑制率 %）Table 2 Post-emergence herbicidal activity of 5(a-i) at 90 g /hm2 (foliar spray method, inhibition rate %)

3 討論與結論

α-三聯(lián)噻吩是潛在的轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑被廣泛研究，是具有良好的除草活性的植物源除草劑［9］，另外，雜環(huán)尤其是含氮雜環(huán)類化合物具有毒性低、活性高、用量少、選擇性好等特點［15-16］，是重要的農(nóng)藥合成中間體。例如，咪唑、異惡唑等及其衍生物，在除草、殺菌、殺蟲等方面具有良好生物活性，也是新農(nóng)藥創(chuàng)制過程中常用的藥效團［17-23］。本試驗基于除草劑新靶標轉(zhuǎn)酮醇酶，采用農(nóng)藥分子合理設計的原理，對α-三聯(lián)噻吩進行先導優(yōu)化，通過醛胺縮合、親核取代及閉環(huán)反應合成了一系列異噁唑胺類化合物5(a-i)，由于合成氯代芳（雜）環(huán)醛肟3 的過程中，副產(chǎn)物丁二酰亞胺不溶解于乙醚，因此，采用乙醚萃取，可以除去副產(chǎn)物，便于純化。此外，試驗發(fā)現(xiàn)僅含有活潑α 氫的乙腈衍生物與氯代芳（雜）環(huán)醛肟反應生成異噁唑胺化合物，因此，本研究選擇具有活潑α 氫的呋喃甲酰乙腈、噻吩甲酰乙腈等為原料合成目標化合物。

為了兼顧田間危害情況和生物學分類［24］，本試驗選取禾本科雜草馬唐和闊葉雜草反枝莧為供試植株，活性測試結果表明，含有苯并咪唑基團的化合物5c 和5f 表現(xiàn)出高的除草活性，對馬唐和反枝莧的根莖抑制率達到90%～96%，其優(yōu)于對照藥劑丙炔氟草胺（80%～88%），在R2位置采用苯并咪唑基團有利于提高化合物除草活性，此外，化合物具有較低的疏水常數(shù)可能有助于提高對雜草的苗后除草活性。因此，5c 和5f 作為除草活性候選化合物，值得進一步結構優(yōu)化改造。