建蘭花葉病毒廣東分離物TGBp1 生物信息學(xué) 分析及抗血清制備

宋若楠，饒雪琴

(廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

蘭花（Cymbidium spp.）是我國花卉產(chǎn)業(yè)的重要支柱，病毒病害在蘭花生產(chǎn)中發(fā)生普遍，呈逐年加重趨勢(shì)，使蘭花生產(chǎn)受到極大影響。已報(bào)道侵染蘭花的病毒有多種，建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）是危害蘭花生產(chǎn)的最重要 病 毒 之 一［1］。CymMV 屬 于 馬 鈴 薯X 病 毒 屬（Potexvirus），基因組為正單鏈RNA［2］，5' 端有帽子結(jié)構(gòu)，3'端有poly（A），包含5 個(gè)開放閱讀 框（open reading frame, ORF）［3］。ORF1 編 碼依賴RNA 的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp），ORF2-4 編碼重疊的三基因連鎖 蛋 白（triple gene block protein, TGBp）TGBp1/TGBp2/TGBp3， 即 運(yùn) 動(dòng) 蛋 白（movement protein, MP）［4］，ORF5 編碼衣殼蛋白（coat protein，CP）［5］。

目前，國內(nèi)對(duì)CymMV 的研究集中在該病毒基因序列［6］和檢測(cè)技術(shù)，如血清學(xué)、生物學(xué)、電鏡觀察等［7-8］，有關(guān)對(duì)CymMV 病毒蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白TGBp1 基因研究報(bào)道不多。本研究以前期構(gòu)建的CymMV 廣東優(yōu)勢(shì)病毒的全基因序列侵染性克隆為材料，構(gòu)建CymMV TGBp1 原核表達(dá)載體，并制備其抗體，為進(jìn)一步研究CymMV TGBp1 的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CymMV 侵染性克隆本研究室保存；新西蘭大白兔購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；pET-28a（+）載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α 菌株和Rossetta（DE3）菌株均購自上海唯地生物有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已知的TGBp1 序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長的引物，在上下游引物引入BamH Ⅰ/Sac Ⅰ酶切位點(diǎn)，引物合成由北京奧科生物公司完成。引物序列為：TGBp1-F：5'-GGGATCCATGGAGCTGGCGTACT TAG-3'；TGBp1-R：5'-GGAGCTCTCAGGTGG-3'。

1.3 TGBp1 的生物信息學(xué)特性分析

利 用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析； 通過WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/） 和TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TargetP1.1/index.php）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析；應(yīng)用TMHMM Server v2. 0（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；通過在線工具SOMPA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.4 TGBp1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pET-28a（+）載體用BamH Ⅰ/Sac Ⅰ進(jìn)行雙酶切，與同樣雙酶切得到的目的基因進(jìn)行連接，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 菌株，挑取菌落進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定，以獲取含目的基因的重組質(zhì)粒。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將鑒定為陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rossetta（DE3）菌株，挑取陽性單菌落接種到含Kan 抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下震蕩培養(yǎng)，直至菌液OD 值為0.6 時(shí)，然后分別加IPTG 至5 mL 誘導(dǎo)好的菌液中，使其終濃度為0.5、0.6、0.7 和0.8 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間分別為4、5、6 和7 h，以優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和IPTG 濃度。分別取不同IPTG 誘導(dǎo)濃度及不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌液1 mL 用PBS 重懸，超聲破碎，利用SDS-PAGE 對(duì)離心后的上清和沉淀分別進(jìn)行重組蛋白的可溶性分析。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，冰浴超聲波破碎后，收集上清，按照Clontech 公司的Histag 融合蛋白純化操作說明進(jìn)行重組蛋白純化，并進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.6 TGBp1 重組蛋白抗血清的制備及效價(jià)測(cè)定

將純化后的重組蛋白（250 μg /mL）作為抗原制備抗血清。第1 次注射75 μg 純化的融合蛋白到兔子耳靜脈；之后取500 μg 純化的融合蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合，乳化后作為抗原進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射；每7 d 免疫1 次，共免疫6 次。最后1次用250 μg純化的融合蛋白加強(qiáng)注射兔子耳靜脈。免疫7 d 后，耳靜脈采血測(cè)定效價(jià)，效價(jià)達(dá)到要求即大量提取抗血清。注射抗原前取兔子耳靜脈血血清作為陰性對(duì)照。

1.7 Western blot 分析

將變性后的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE，并經(jīng)以IPTG 誘導(dǎo)的未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的Rossetta（DE3）菌體裂解液和未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化了pET-28a（+）重組質(zhì)粒的Rossetta（DE3）菌體裂解液為對(duì)照。電泳結(jié)束后，通過電轉(zhuǎn)移將SDS-PAGE 膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，以制備的多克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 為二抗，通過堿性磷酸酶標(biāo)記的顯色劑檢測(cè)表達(dá)的重組蛋白。利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）進(jìn)行觀察，拍照記錄結(jié)果。

1.8 抗血清的效價(jià)測(cè)定

抗原濃度稀釋到5 μg /mL，純化的蛋白做陽性對(duì)照，免疫前未稀釋的兔血清做陰性對(duì)照，并設(shè)置清水為空白對(duì)照?？寡逵煤?.1% 牛血清白蛋白的磷酸緩沖液進(jìn)行稀釋，稀釋度為1∶21～1∶230，用間接ELISA法進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，具體參考鄧叢良等［9］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGBp1 生物信息學(xué)分析

利用WoLF PSORT 和TargetP1.1 Server 對(duì)TGBp1 氨基酸序列進(jìn)行了定位分析，WoLF PSORT預(yù)測(cè)結(jié)果顯示TGBp1 含有細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)，TargetP1.1 Server 預(yù)測(cè)TGBp1 可以定位在任何位置。因此，TGBp1 亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。利用InterPro 和TMHMM Server2. 0 在線工具對(duì)TGBp1 氨基酸序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，TGBp1 從第26 位氨基酸到第223位氨基酸是一個(gè)保守的解旋酶結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域。通過在線工具SOMPA 對(duì)TGBp1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，TGBp1 二級(jí)結(jié)構(gòu)中α- 螺旋占24.46%，延伸鏈占14.97% ；β- 轉(zhuǎn)角占4.72%，無規(guī)卷曲占51.07%。

2.2 TGBp1 基因的克隆和重組原核表達(dá)pET28a-TGBp1 的鑒定

以CymMV 質(zhì)粒DNA 為模板，用特異性引物TGBp1-F/TGBp1-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，為702 bp（見圖1）。分別將目的基因與同樣用BamH Ⅰ/Sac Ⅰ雙酶切的載體pET-28a（+）進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)pET28a-TGBp1重組菌落進(jìn)行PCR 鑒定。電泳結(jié)果表明，菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致。測(cè)序結(jié)果表明，TGBp1成功克隆到pET-28a（+）載體中。

2.3 TGBp1 基因的原核表達(dá)及表達(dá)優(yōu)化

重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-TGBp1 轉(zhuǎn)化Rossetta（DE3）菌株后，菌體經(jīng)超聲破碎后離心，對(duì)上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果顯示，融合蛋白主要存在于菌體沉淀物中。含pET28a-TGBp1的重組菌經(jīng)不同濃度的IPTG 誘導(dǎo)以及不同時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá)，再進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳分析表明，融合蛋白的最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.6 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間是5 h（見圖2A、2B）。

圖2 不同IPTG 濃度和不同誘導(dǎo)時(shí)間下His 融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 電泳分析Fig.2 Analysis of prokaryotic expression products of His fusion protein by SDS-PAGE in different IPTG concentration and different induction time

2.4 抗血清效價(jià)測(cè)定

用純化的融合蛋白作為抗原制備抗血清，用間接ELISA 法檢測(cè)CymMV TGBp1 抗血清效價(jià)。間接ELISA 結(jié)果表明，抗血清稀釋至524 288 倍時(shí)，仍然具有明顯的陽性反應(yīng)（圖3），表明該抗血清效價(jià)可達(dá)524 288 倍。

圖3 間接ELISA 測(cè)定CymMV TGBp1 多克隆抗體效價(jià)Fig. 3 Polyclonal antibody titer of CymMV TGBp1 tested by indirect ELISA

2.5 Western blot 檢測(cè)

以制備的TGBp1 多克隆抗體對(duì)融合蛋白進(jìn)行免疫檢測(cè)，結(jié)果表明，在目的蛋白位置有明顯雜交帶（見圖4），說明所制備的抗血清可以與誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白His-TGBp1 發(fā)生抗原-抗體識(shí)別反應(yīng)，為?；钥寡?。

圖4 His-TGBp1 融合蛋白的Western blot 分析Fig.4 Analysis of fusion protein of His-TGBp1 by Western blot

3 討論與結(jié)論

本研究分析了CymMV 廣東分離物 TGBp1 的生物信息學(xué)，構(gòu)建了CymMV TGBp1 基因的原核表達(dá)載體，優(yōu)化了蛋白表達(dá)條件，同時(shí)制備了高效價(jià)的TGBp1 多克隆抗體，為該蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)室前期完成了CymMV 廣東分離物的基因組測(cè)序［6］，但TGBp1 的功能有待進(jìn)一步了解。本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)CymMV TGBp1進(jìn)行全面分析預(yù)測(cè)，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，TGBp1 可定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，且有一個(gè)保守的解旋酶結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域，這與Wong 等［3］和Kalinina 等［10］研究結(jié)果一致；此外，TGBp1 還包含α-螺旋和β-折疊，無規(guī)卷曲所占比例很高，可能與蛋白質(zhì)的生物活性及區(qū)域功能有關(guān)［11］。

通?？寡宓目乖苽浞椒ㄓ? 種，利用原核表達(dá)制備的蛋白以及提純的病毒都可以作為制備抗血清的抗原。本研究以原核表達(dá)獲得融合蛋白作為抗原免疫兔子，獲得了高效價(jià)的多克隆抗血清。也有學(xué)者利用提純的病毒作為抗原，如孟春梅［12］通過提純感病蘭花上的CymMV，制備了CymMV 單克隆抗體；朱英芝等［13］通過提純小西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）的羅漢果分離物，免疫新西蘭大白兔，成功制備出抗血清。與提純病毒制備抗原相比，原核表達(dá)操作簡(jiǎn)便，不受外界環(huán)境條件限制，同時(shí)可以節(jié)省時(shí)間。

誘導(dǎo)條件是影響大腸桿菌外源基因高效表達(dá)的重要步驟。本研究對(duì)pET28a-TGBp1 的重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)TGBp1 融合蛋白的最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.6 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間是5 h，然而外源基因的表達(dá)效率通常受大腸桿菌表達(dá)菌株、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、初始菌液濃度等因素的影響［14］，即使是同一種外源基因在不同的誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)中，由于表達(dá)菌株不同，誘導(dǎo)表達(dá)條件也不相同［15］。本研究所制備的高效價(jià)血清為進(jìn)一步研究TGBp1 功能奠定了良好基礎(chǔ)。