黃花菜八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS 的克隆及VIGS 轉(zhuǎn)化表達(dá)驗(yàn)證

李 森，程宵婧，侯非凡，公菲菲，劉 娟，杜 崴，亢秀萍，邢國(guó)明

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 / 山西省設(shè)施園藝工程技術(shù)中心，山西 太谷 030801 ；2.大同黃花產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，山西 大同 037004）

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）是百合科（Liliaceae）萱草屬（Hemerocallis L.）宿根草本植物，是一種兼具食用、觀賞與藥用價(jià)值的多功能特色蔬菜，因具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值而受到廣泛關(guān)注。目前在山西、湖南、甘肅等主產(chǎn)區(qū)，黃花菜已成為發(fā)展特色農(nóng)業(yè)的代表性作物。黃花菜遺傳背景復(fù)雜，基因組龐大（約3.2 Gb），目前遺傳轉(zhuǎn)化體系不完善，獲得轉(zhuǎn)基因植株難度較高，導(dǎo)致基因功能研究相對(duì)滯后。

八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase，PDS）是植物類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶［1］，位于類胡蘿卜素合成途徑的上游，它能催化無(wú)色的八氫番茄紅素脫氫，生成ζ-胡蘿卜素，繼而生成番茄紅素，轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩念惡}卜素［2］。以煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）作為載體誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）是一種新型的反向遺傳學(xué)研究工具，已在多種植物中成功鑒定了上百種基因，廣泛應(yīng)用于植物抗病、逆境脅迫及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因的研究［3-5］。當(dāng)PDS 基因被沉默時(shí)，植物類胡蘿卜素合成途徑受阻，植株會(huì)表現(xiàn)出較為明顯光漂白現(xiàn)象［6］，因此其常作為參照基因來(lái)評(píng)價(jià)VIGS 體系是否構(gòu)建成功［7］。Zhong 等人利用煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）作為病毒載體，插入PDS 基因后構(gòu)建重組病毒載體TRV-PDS，真空侵染唐菖蒲球莖和幼嫩植株，使葉片出現(xiàn)了不同程度的光漂白現(xiàn)象［8］。WEGE等人在花菱草的莖尖、葉背、葉柄注射含有TRVPDS 的農(nóng)桿菌菌液，2 周后92% 的植株花瓣、果實(shí)、嫩枝及葉片開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的光漂白現(xiàn) 象［9］。徐華利用TRV-PDS 菌液侵染百合幼苗后，葉片出光漂白現(xiàn)象［10］。

本課題組前期對(duì)黃花菜地方品種‘大同黃花’的不同組織器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果中得到功能注釋為Phytoene desaturase 的Unigene 序列。本研究通過(guò)PCR 技術(shù)克隆得到此Unigene 全長(zhǎng)作為黃花菜PDS 基因序列（HcPDS），利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)HcPDS 基因翻譯所得的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能進(jìn)行了分析，構(gòu)建了攜帶HcPDS 基因片段的VIGS 重組病毒載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌侵染黃花菜實(shí)生苗驗(yàn)證其效果，建立了黃花菜VIGS 轉(zhuǎn)化體系，為黃花菜功能基因的分析研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品

基因克隆載體pMD?19-T 購(gòu)于TaKaRa 公司，目錄號(hào)為6013。用于建立VIGS 體系的TRV 病毒載體（pTRV1、pTRV2）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)徐進(jìn)課題組惠贈(zèng)。大腸桿菌（DH5α 感受態(tài)細(xì)胞）購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司，目錄號(hào)為CB101。農(nóng)桿菌（GV3101 感受態(tài)細(xì)胞）購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，目錄號(hào)為ZC141。

1.2 黃花菜幼苗培育

供試植物材料為‘大同黃花’（Hemerocallis citrina cv. ‘Datonghuanghua’）。秋季收集‘大同黃花’自然授粉后所形成的種子。參考侯非凡［10］的方法進(jìn)行種子催芽，具體步驟如下：用自來(lái)水沖洗干凈種子表面的雜質(zhì)，用75%乙醇浸泡種子約1 min，然后用滅菌蒸餾水將種子沖洗2 次，之后將種子放置在鋪有吸水紙和紗布的培養(yǎng)皿中，種子上面再覆蓋1 層浸濕紗布，將培養(yǎng)皿放于28 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。種子約10 d 后開(kāi)始露白，露白的種子播種于基質(zhì)配比為草炭∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1 的穴盤中，取28 d 齡的幼苗用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 HcPDS 基因片段的克隆

課題組前期對(duì)‘大同黃花’根、花、葉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)篩查測(cè)序所得數(shù)據(jù)庫(kù)，找到功能注釋為PDS 的Unigene 序列c50463.graph_c0，在UTR（Untranslated region）區(qū)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物cPDS-F。提取‘大同黃花’的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄、PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物回收、T 載體的連接方法同公菲菲［11］，連接T 載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR，選取與目的條帶一致的菌液送北京華大基因進(jìn)行Sanger 測(cè)序。

表1 黃花菜HcPDS 基因VIGS 沉默體系構(gòu)建所涉及引物Table 1 Primers for VIGS transformation system of HcPDS gene in Hemerocallis citrina

使用DNAMAN7.0 對(duì)測(cè)序得到的序列與轉(zhuǎn)錄本c50463.graph_c0 參考序列進(jìn)行比對(duì)和校準(zhǔn)；通過(guò)NCBI-blastX 進(jìn)行物種間序列比對(duì)，定義克隆序列；使用ExPASy -Translate tool 軟件（https://web.expasy.org/translate/）翻譯得到氨基酸序列，并使用NCBI-CD Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi））進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.4 蛋白序列分析

使用P r o t P a r a m（h t t p://w e b.e x p a s y.o rg/protparam/）、Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）對(duì)HcPDS 蛋白的基本理化性質(zhì)、親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。在 NCBI-blastp 進(jìn)行同源性比對(duì)，下載相關(guān)基因的蛋白序列，使用MAFFT 進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后使用MEGA5.0 構(gòu)建蛋白進(jìn)化樹(shù)，采用NJ 法（Neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap 值由1000 次重復(fù)得到［12］。

1.5 重組病毒載體pTRV2-HcPDS 構(gòu)建

針對(duì)HcPDS 中322 bp（CDS 區(qū)段+3’UTR 區(qū)段）特異性片段，使用Snapgene 設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)，在HcPDS 特異性片段兩端分別選18 ～ 25 個(gè)堿基，再加上TRV2 空載的EcoR I 酶切位點(diǎn)左側(cè)和Kpn I 酶切位點(diǎn)右側(cè)的20 個(gè)左右堿基合成擴(kuò)增引物pTRV2-HcPDS-F/R。用含有HcPDS 正確測(cè)序結(jié)果的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同公菲菲（退火溫度為56 ℃）［11］。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收 目的片段。

使用EcoR I、Kpn I 對(duì)pTRV2 載體進(jìn)行37 ℃過(guò)夜酶切，然后回收pTRV2 載體。切膠回收產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)雙酶切后的pTRV2 載體進(jìn)行重組連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后，在含有卡那霉素Kan（50 μg/mL）的培養(yǎng)條件下篩選轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒并交由北京華大測(cè)序公司測(cè)定序列信息，將測(cè)序正確的菌液擴(kuò)增培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，得到重組表達(dá)載體，命名為pTRV2-HcPDS。

1.6 VIGS 體系的構(gòu)建

參考唐菖蒲和百合構(gòu)建黃花菜VIGS 侵染的方法體系［8-9］。將1 μg pTRV2-HcPDS 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（GV3101 感受態(tài)細(xì)胞）中，熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在含卡那霉素和利福平抗性的LB 固體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)2 ～3 d 后篩選單菌落，挑取單菌落轉(zhuǎn)入加有500 μL 抗性LB 液體培養(yǎng)基的1.5 mL 離心管中，28 ℃ 200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)，同時(shí)培養(yǎng)pTRV1 菌株和pTRV2 空載菌株。使用引物TRV1-F/R 和TRV2-F/R進(jìn)行菌液PCR，選取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同1.5 中的PCR 程序（退火溫度為56 ℃）。將100 μL 菌液加入裝有7 ～8 mL 抗性LB 液體培養(yǎng)基的50 mL 離心管中，28 ℃ 200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)。第2 天吸取3 mL 渾濁菌液加入到裝有150 mL 抗性LB 液體培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，28 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。第3 天將錐形瓶中渾濁的菌液分裝到50 mL離心管中，5 000 r/min 離心8 min 集菌。

向離心管中加入當(dāng)天配制的侵染液（10 mmol/L MES + 200 mmol/L 乙酰丁香酮 + 10 mmol/L MgCl2）來(lái)懸浮菌液，使各菌液OD600=1.0，把菌液按照VTRV1∶VTRV2=1∶1 和VTRV1∶VTRV2-HcPDS=1∶1 混 合，混合后在暗處?kù)o置4 ～6 h。用紗布將28 d 齡的黃花菜幼苗包好浸沒(méi)在侵染液中，真空抽至7 000 Pa 后保壓5 min，再緩慢放氣10 min，重復(fù)1 次。在自來(lái)水下沖洗幼苗數(shù)次，將幼苗根部浸入水中，10 ℃放置 2 d，再定植于基質(zhì)（草炭：珍珠巖：蛭石=3∶1∶1）中，放置于氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察沉默植株（接種pTRV1+pTRV2-HcPDS）、陰性對(duì)照植株（pTRV1+pTRV2-空載）、空白植株（未接種TRV 病毒）的表型性狀，拍照記錄。沉默植株、陰性對(duì)照植株及空白植株各處理30 株幼苗。

1.7 VIGS 沉默效果檢測(cè)

為鑒定pTRV2-HcPDS 載體是否能夠在黃花菜中發(fā)揮作用，能否使HcPDS 基因沉默，在30 d 時(shí)采集沉默植株、陰性對(duì)照植株及空白植株的新生葉片，使用RT-qPCR 檢測(cè)HcPDS 基因的表達(dá)水平。RT-qPCR 方法參照TaKaRa 公司TB Green ? Premix Ex Taq ? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；RT-qPCR 引物為qPDS-F/R，內(nèi)參基因選用Act-F/R，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考公菲菲［12］。進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量［13］。使用SPSS 軟件中的Duncan’s 法進(jìn)行單因素方差分析［14］?；虮磉_(dá)量結(jié)果通過(guò)GraphPad Prism 7 軟件繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HcPDS 基因片段克隆與分析

在‘大同黃花’轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中查找功能注 釋 為PDS 的Unigene 序 列c50463.graph_c0，以‘大同黃花’嫩葉的cDNA 為模板，在該Unigene的UTR 區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物cPDS-F/R，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后得到約2 100 bp 的序列（圖1a）。將PCR 產(chǎn)物連接T 載體送測(cè)，將拼接后的送測(cè)結(jié)果經(jīng)NCBI-ORF Finder 分析，Unigene 的ORF 區(qū)（Open Reading Frame）片段長(zhǎng)1 710 bp（圖1b），編碼570 個(gè)氨基酸。通過(guò)NCBI-CD Search 預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域（圖1c），在特定匹配中具有較高置信度（E-value=0）的保守結(jié)構(gòu)域PLN02612，其長(zhǎng)度為530 aa；在非特定匹配中具有較高置信度（E-value=0）的保守結(jié)構(gòu)域phytoene desat（TIGR02731）；且含有NADbinding domain（COG3349），此結(jié)構(gòu)域?yàn)榘被崦摎涿傅妮o酶結(jié)合域。通過(guò)NCBI-blastX 進(jìn)行不同物種間的序列比對(duì)，該Unigene 表達(dá)的蛋白質(zhì)存在與其他物種相似的Phytoene desaturase 保守域結(jié)構(gòu) （見(jiàn)表2），因此將該Unigene 命名為HcPDS 基因。

圖1 HcPDS 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序正確的ORF 序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.1 The PCR product, sequencing correct ORF sequence, corresponding amino acid sequence, and protein structure of HcPDS gene

表2 HcPDS 核酸序列NCBI-blastX 部分結(jié)果Table 2 NCBI-blastX results of HcPDS nucleicacid sequence

2.2 HcPDS 蛋白分析

利用ProtParam 對(duì)HcPDS 基因編碼的蛋白序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，HcPDS 蛋白的分子量為63.719 72 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為7.53，分子式為C2884H4522N758O819S25。HcPDS 蛋白由20 種氨基酸組成，其中亮氨酸（Leu）的含量最高，占總氨基酸含量的10.5%。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為51.9（高于40），總平均親水性（GRAVY）為 -0.136，說(shuō)明HcPDS 蛋白為親水不穩(wěn)定性蛋白。通過(guò)Protscale 對(duì)HcPDS 蛋白進(jìn)行親、疏水性分析，結(jié)果表明第93位的天冬氨酸（Arg）親水性最強(qiáng)，為-2.811；第231 位的異亮氨酸（Leu）疏水性最強(qiáng)，為2.489。

通過(guò)SWISS-MODEL 在線軟件模擬HcPDS蛋白序列的可能結(jié)構(gòu)（圖2）。HcPDS 蛋白與已知模板蛋白5mog.1（Oryza sativa phytoene dehydrogenase）的氨基酸序列具有87.68%的一致性，可信度（GMQE）為0.77，與模板蛋白匹配度（QMEAN）為-0.34。HcPDS 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中具有多種二級(jí)結(jié)構(gòu)（螺旋、折疊、卷曲），具有明顯的折疊層次。

圖2 HcPDS 蛋白三維結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Three-dimensional structure of HcPDS protein

2.3 HcPDS 蛋白同源性比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

將HcPDS 氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp 比對(duì)，分析HcPDS 蛋白同源性。結(jié)果表明，黃花菜中的HcPDS 蛋白與洋水仙Narcissus pseudonarcissus、蘆筍Asparagus officinalis、油棕Elaeis guineensis 等百余種物種存在較高同源性，E-Value 均大于90%，一致性均大于80%。蛋白比對(duì)結(jié)果顯示（圖3），HcPDS 蛋白與洋水仙、蘆筍、水稻、擬南芥等4 個(gè)物種中的PDS 蛋白相比，有402 個(gè)相同的氨基酸，65 個(gè)強(qiáng)保守氨基酸，32 個(gè)弱保守氨基酸，N 端序列差異比C 端大。

通 過(guò)MEGA5.0 的NJ（Neighbor-joining） 法分析HcPDS 氨基酸序列及與其相似性大于60%的同源蛋白氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，單子葉植物和雙子葉植物PDS 蛋白明顯分為兩大枝。在單子葉植物分支中，HcPDS蛋白與洋水仙Narcissus pseudonarcissus、中國(guó)水仙Narcissus tazetta subsp. Chinensis、 番 紅 花Crocus ancyrensis、蘆筍Asparagus officinalis 的PDS 蛋白親緣關(guān)系最近。

圖3 PDS 蛋白序列比對(duì)Fig.3 PDS protein sequence alignment

圖4 HcPDS 蛋白與其他物種PDS 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of PDS protein from Hemerocallis citrina and other species

2.4 黃花菜重組病毒載體pTRV2-HcPDS 的構(gòu)建

以含有HcPDS 全長(zhǎng)且測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒作為模板，使用重組引物pTRV2-HcPDS-F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段顯示：在350 bp 附近出現(xiàn)目標(biāo)條帶，且條帶清晰單一，與前期預(yù)期結(jié)果相符（圖5a）。將所回收的PCR 產(chǎn)物與雙酶切后的pTRV2 進(jìn)行重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選單克隆后送北京華大測(cè)序公司測(cè)序。運(yùn)用DNAMAN 分析測(cè)序結(jié)果顯示：成功克隆到322 bp 黃花菜HcPDS 特異性基因片段，說(shuō)明pTRV2-HcPDS 基因沉默載體構(gòu)建成功。

通過(guò)熱激法將陽(yáng)性克隆載體pTRV2-HcPDS 進(jìn)行農(nóng)桿菌（GV3101）轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的pTRV2-HcPDS菌液、pTRV1 菌液、pTRV2 菌液劃線于含Kan+Rif抗性LB 固體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)2 ～3 d 挑取單菌落，分別進(jìn)行菌液PCR（圖5b），挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后用于黃花菜幼苗的侵染。

注：a 為重組引物回收目的基因，M 為DL2000 DNA Marker，1 為負(fù)對(duì)照，2 為目的基因；b 為單菌落PCR 結(jié)果，M 為DL2000 DNA Marker，1 為負(fù)對(duì)照，2 為pTRV1，3 為pTRV2，4 為pTRV2-HcPDS。

2.5 表型鑒定及HcPDS 基因表達(dá)水平檢測(cè)

以黃花菜四周齡的幼苗為試驗(yàn)材料，通過(guò)真空滲透法將含有病毒載體的農(nóng)桿菌滲透進(jìn)入黃花菜葉片內(nèi)。葉片真空侵染后呈現(xiàn)水漬狀。在接種30 d 后，與陰性對(duì)照植株和空白對(duì)照植株相比，接種pTRV2-HcPDS 的植株新葉上出現(xiàn)了光漂白現(xiàn)象。為進(jìn)一步探討該現(xiàn)象是否是由TRV 載體沉默引起的，分別檢測(cè)了沉默植株、陰性對(duì)照植株和空白植株的TRV 病毒感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沉默植株的新生葉片上分別檢測(cè)到了pTRV1 和pTRV2。

為了驗(yàn)證HcPDS 的沉默，在30 d 時(shí)采集了沉默植株、陰性對(duì)照植株和空白植株的新葉進(jìn)行了HcPDS 基因相對(duì)表達(dá)量分析。結(jié)果如圖6 顯示，相比于陰性對(duì)照植株和空白植株，沉默植株的HcPDS基因表達(dá)量顯著下降，其表達(dá)量相較于陰性對(duì)照植株下降了73.33%，相較于空白對(duì)照植株下降了71.72%，而TRV2 空載的陰性對(duì)照與空白對(duì)照之間無(wú)顯著差異。

圖6 黃花菜幼苗不同處理下HcPDS 基因的表型和相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Phenotype and relative expression of HcPDS gene in different treatments of Hemerocallis citrine seedlings

3 討論和結(jié)論

PDS 基因是類胡蘿卜素合成途徑的重要基因，類胡蘿卜素是植物重要的呈色物質(zhì)之一。本研究首次在萱草屬植物中克隆得到八氫番茄紅素脫氫酶基因HcPDS 的cDNA 全長(zhǎng)，ORF 區(qū)片段長(zhǎng)1710 bp，編碼570 個(gè)氨基酸。分析表明，該序列與水仙、蘆筍、油棕和番紅花等已克隆并驗(yàn)證過(guò)功能的PDS基因具有較高的同源性，且含有與其它物種相似的Phytoene desaturase 蛋白結(jié)構(gòu)，說(shuō)明該基因在進(jìn)化過(guò)程中較為保守，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中控制色素合成具有重要作用。

沉默PDS 基因會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的光漂白現(xiàn)象，所以該基因通常被作為檢測(cè)VIGS 轉(zhuǎn)化體系是否成功的報(bào)告基因［16］。本研究以4 周齡的黃花菜幼苗為試驗(yàn)材料，通過(guò)TRV 誘導(dǎo)的VIGS 體系，發(fā)現(xiàn)被pTRV2-HcPDS 侵染的植株新葉出現(xiàn)不完全的光漂白現(xiàn)象，這與Zhong 等人［8-10］的研究現(xiàn)象一致，且通過(guò)RT-qPCR 發(fā)現(xiàn)葉片中的HcPDS 基因表達(dá)量相比接種TRV2 空載的陰性對(duì)照和空白對(duì)照植株分別下降了73.33%和71.72%。空白對(duì)照和陰性對(duì)照植株葉片則無(wú)光漂白現(xiàn)象出現(xiàn)，且空白對(duì)照和陰性對(duì)照的HcPDS 基因表達(dá)量相比無(wú)顯著差異。進(jìn)一步證明了本研究構(gòu)建的黃花菜VIGS 體系可有效沉默HcPDS 基因。

VIGS 技術(shù)是作為一種研究功能基因的反向遺傳學(xué)手段，已廣泛應(yīng)用于植物器官形成、生長(zhǎng)發(fā)育、抗病蟲(chóng)害、非生物脅迫、次生代謝及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生化過(guò)程中的相關(guān)基因功能研究，在植物功能基因組學(xué)方面發(fā)揮著重要作用［17］。目前，已成功在番茄［16］、煙草［19］、擬南芥［20］等多種植物中構(gòu)建了適合本物種的VIGS 體系。在TRV 介導(dǎo)的VIGS體系中接種時(shí)期、接種方法、農(nóng)桿菌接種濃度等因素直接影響接種成功率和基因沉默效率［8］。本研究中首次將VIGS 體系應(yīng)用于萱草屬植物，參考其他物種的侵染條件選用OD600=1.0 的農(nóng)桿菌液和真空滲透法處理黃花菜幼苗。黃花菜幼苗在接種重組病毒載體30 d 后，其新生葉出現(xiàn)了較為明顯的黃色斑點(diǎn)，但其并未出現(xiàn)完全的光漂白現(xiàn)象，后期需在進(jìn)一步對(duì)農(nóng)桿菌接種濃度和接種時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。綜合表型鑒定和表達(dá)檢測(cè)兩項(xiàng)結(jié)果分析，利用TRV構(gòu)建黃花菜VIGS 載體能夠有效沉默目的基因片段，可用于后續(xù)黃花菜基因功能研究。

本研究克隆得到了黃花菜HcPDS 基因序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有PDS 基因家族典型的Phytoene desat 結(jié)構(gòu)域。通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)HcPDS 基因與水仙、蘆筍等植物中的PDS 基因具有較高的同源性。首次構(gòu)建了黃花菜HcPDS 基因的VIGS 轉(zhuǎn)化體系，黃花菜幼苗被侵染后，接種pTRV2-HcPDS 的植株新葉出現(xiàn)不完全的光漂白現(xiàn)象，葉片中的HcPDS 基因表達(dá)量相比接種TRV2 空載的陰性對(duì)照和空白對(duì)照植株分別下降了73.33%和71.72%，說(shuō)明此VIGS 體系能夠有效沉默目的基因片段，克服了黃花菜基因組未知等障礙，為黃花菜基因功能的研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。