藥用微生物育種技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展

呂孫燕,汪 祎,陳金蕓,王 鴻,章華偉

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

微生物次級代謝產(chǎn)物具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性和顯著的生物活性。據(jù)統(tǒng)計(jì),微生物來源的活性天然產(chǎn)物已達(dá)22 500種,其中45%來源于放線菌,38%來源于真菌,17%由小單胞菌產(chǎn)生,且微生物先導(dǎo)化合物已占據(jù)了臨床用藥50%以上[1]。然而,野生型菌株先導(dǎo)物的產(chǎn)量低、成分復(fù)雜,后期制備分離成本高,往往導(dǎo)致其無法產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。誘變育種是一種利用物理、化學(xué)和生物等因素使機(jī)體的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的技術(shù),可以提高先導(dǎo)藥物的產(chǎn)量和質(zhì)量,并誘導(dǎo)其產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的化合物。由于突變率高、操作方便和突變周期短等優(yōu)點(diǎn),誘變育種技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于菌種改造[2]。常見的誘變育種方式有物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變和復(fù)合誘變。筆者通過大量文獻(xiàn)查閱和梳理,系統(tǒng)介紹4種誘變育種方式中的各種誘變育種的技術(shù)原理及其在成功應(yīng)用案例,并為不同菌株的誘變劑的選擇提供參考。

1 物理誘變

輻照誘變是傳統(tǒng)物理誘變中運(yùn)用較多的技術(shù),主要通過各類射線對微生物菌株進(jìn)行輻照,包括紫外線(UV)、X射線、γ射線和中子等。近年來,微波誘變、熱誘變、離子束誘變和大氣室溫等離子體(ARTP)誘變等新型物理誘變技術(shù)也得到了廣泛應(yīng)用。

1.1 傳統(tǒng)物理誘變技術(shù)

1.1.1 紫外(UV)誘變

紫外對于微生物的作用機(jī)制有很多個解釋,其中研究的比較清楚的一個作用機(jī)制是紫外線能使DNA分子形成嘧啶二聚體,即2個相鄰的嘧啶通過共價鍵連接[3]。這種嘧啶二聚體的出現(xiàn)不但會減弱雙鍵之間氫鍵的作用,引起DNA雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形,阻礙堿基的配對,從而引發(fā)突變或死亡,而且會妨礙DNA雙鏈的解開,影響DNA正常的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而引起突變[4]。朱相成等[5]以產(chǎn)6-脫氧博來霉素的鏈霉菌株SB9026作為出發(fā)菌株,在紫外波長為254 nm的條件下照射6 min,得到了較高產(chǎn)菌株,效價達(dá)(26.0±1.8)mg/L,比原始菌株的初始滴度提高了30%。張健[6]對青霉素產(chǎn)生菌青霉菌(Penicilliumsp.)進(jìn)行紫外誘變后,青霉素?fù)u瓶產(chǎn)量比原始菌株高20%左右,灰黃霉素?fù)u瓶產(chǎn)量比原始菌株高10%左右,并且經(jīng)過10代遺傳后產(chǎn)青霉素的產(chǎn)量基本穩(wěn)定。Feng等[7]從霉變的果實(shí)中分離出一株米曲菌(Aspergillusoryzae),并能產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物曲酸,以此菌株作為起始菌株KA-11,距紫外燈40 cm處照射30 min后,通過篩選后得到高產(chǎn)菌株UV-22,比原始菌株曲酸的產(chǎn)量提高了87.1%,其中正突變率為61.2%。

1.1.2 激光法誘變

激光誘變技術(shù)作用于生物體已經(jīng)有30多年的歷史,激光的熱、壓力、光和電磁場的效應(yīng)能夠引起生物體的反應(yīng),即酶失活、蛋白質(zhì)變性、組織變形、破裂、DNA損傷和生物分子變異。低功率的激光(波長440～700 nm)器有YAG,He-Cd,Ar+,Ar+,DCM脈沖染料和He-Ne等[8]。朱自平等[9]對藥用真菌桑木耳(Phellinusigniarius)用He-Ne激光在功率為40 mW的He-Ne激光下進(jìn)行40 min的誘變后,進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性篩選,鑒定出一個漆酶活性高的菌株SJZ2,比原始菌株漆酶活性提高36.84%。黃銘杰等[10]以UV-LiCl復(fù)合誘變后的突變株GM120-43為出發(fā)菌株,用半導(dǎo)體激光在功率15 W對其進(jìn)行照射120 s,獲得高產(chǎn)灰黃霉素突變株C1448-1,再使用CO2激光在功率密度(1 448 mW/cm2)誘變后得到一株高產(chǎn)突變株C1448-1,灰黃霉素的效價提高120.69%。劉建龍等[11]對一株產(chǎn)L-纈氨酸的黃色短桿菌(BrevibacteriumflavumBFS)進(jìn)行He-Ne激光誘變育種,實(shí)驗(yàn)通過設(shè)置不同的誘變強(qiáng)度和時間,確定在照射功率15 mW、時間為20 min時,得到一株可以穩(wěn)定遺傳至少10代的突變株,產(chǎn)量對比原始菌株提高25.5%。

1.1.3 γ射線誘變

γ射線誘變的作用機(jī)制是利用放射源放射出的快速運(yùn)動的帶電粒子作用于機(jī)體,使機(jī)體的內(nèi)部物質(zhì)發(fā)生電離或激發(fā),形成正離子和負(fù)離子或激發(fā)態(tài)原子。這些原子或離子與周圍大分子核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng),使遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而產(chǎn)生新物種[12]。白豆等[13]對產(chǎn)1-脫氧野尻霉素(DNJ)的枯草芽孢桿菌黑色變種(Bacillussubtilisvar.niger)進(jìn)行60Co-γ射線誘變,在誘變劑量為800 Gy條件下篩選到得到發(fā)酵液中DNJ表達(dá)量達(dá)到20.7 mg/L的高產(chǎn)菌株,比初始菌株提高了27.7%,可緩解目前DNJ在天然產(chǎn)物中質(zhì)量分?jǐn)?shù)低、分離提取過程中流失大的問題。王軍等[14]以黑曲霉(Aspergillusniger)Co827為出發(fā)菌株,采用高劑量60Co-γ射線輻照,并復(fù)合N+離子注入的方法篩選到菌株CN05,產(chǎn)檸檬酸比出發(fā)菌株提高18.44%。Lazim等[15]以土霉素產(chǎn)生菌鏈霉菌CN08為出發(fā)菌株,用高劑量(2～4 kGy)60Co-γ射線輻照15～30 min后結(jié)合卡那霉素抗性篩選得到高產(chǎn)菌株,比原始菌株土霉素產(chǎn)量提高19倍,為土霉素的生產(chǎn)提供便利。

1.2 新型物理誘變技術(shù)

1.2.1 微波誘變

自18世紀(jì)以來,科學(xué)家對不同頻率的電磁輻射與生物體生命活動的相互作用感興趣,微波的輻射頻率是其中的重要組成部分[16]。微波的頻率為300 MHz～300 GHz,目前最常用的頻率為2 450 MHz。微波作用于微生物的生物效應(yīng)可分為熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。熱效應(yīng)是指一定頻率和波長的微波作用于生物體后引起生物體的局部溫度升高,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一些生化反應(yīng)的效應(yīng);非熱效應(yīng)是指一定頻率和波長的微波作用于生物體后不引起生物體的局部溫度升高,能夠引起生物體強(qiáng)烈的生理生化反應(yīng)的效應(yīng)。微波輻射通過熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)使生物體產(chǎn)生突變,目前普遍認(rèn)為非熱效應(yīng)是微波輻射產(chǎn)生突變的主要來源[17]。倪賽等[18]以具有廣譜抗菌活性的抗生素桔青霉產(chǎn)生菌(Penicilliumsp.)PA-33作為出發(fā)菌株,在誘變條件為微波爐功率700 W,頻率22 kHz,低火處理30 s后得到一株突變體WB-6,活性提高32.29%,正向突變率為61.54%,在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)微波單因子誘變的正向突變率高于微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變。劉鵬等[19]以弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)BL-16菌株為出發(fā)菌株,泰樂菌素初始發(fā)酵效價6 526 mg/L。在微波功率為750 W,脈沖頻率為2 500 MHz對孢子懸液進(jìn)行微波誘變60 s后得到8株正向突變的突變體,其中搖瓶效價最高達(dá)到9 525 mg/L,對比于出發(fā)菌株效價提高了45.95%。

1.2.2 熱 誘 變

熱誘變是一種通過溫度改變來實(shí)現(xiàn)對微生物誘變的手段,至今對熱誘變的作用機(jī)制并不明確,但是有研究表明熱處理可以引起堿基對G-C→C-G的顛換,從而引起微生物的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變[20]。李瑾等[21]以炭樣小單孢菌(Micromonosporacarbon-acea)JXNU-1作為出發(fā)菌株,在76 ℃恒溫水浴中處理10 min后,發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)質(zhì)量抗生素濃度比原始菌株提高98.53%。

1.2.3 重離子束誘變

我國科學(xué)家自1986年發(fā)現(xiàn)重離子注入對水稻的生物學(xué)效應(yīng),開始用離子束法來改良生物的性狀?，F(xiàn)如今重離子注入作為一種新的基因改造手段,在農(nóng)作物和工業(yè)微生物育種中作出了巨大貢獻(xiàn)。通過重離子束誘變能使微生物的遺傳信息發(fā)生改變,從而獲得理想的工業(yè)菌[22]?？娊樀萚23]對谷氨酸棒桿菌12C6+離子束輻照誘變谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum),經(jīng)80MeV/u碳離子束輻照后得到了1株高產(chǎn)菌株GM006,其發(fā)酵最高產(chǎn)酸達(dá)121.1 g/L,比出發(fā)菌株提高了10.09%,該突變菌株GM006是有醫(yī)學(xué)前景谷氨酸工業(yè)菌株。Wang等[24]對阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)采用重離子誘變的方法選育阿維菌素B1A高產(chǎn)突變株,在12C6+重離子輻照阿維鏈霉菌孢子70 Gy后獲得的突變體ZJAV-Y-147和ZJAV-Y-HS,阿維菌素的產(chǎn)量分別為4 822.23,4 632.17 mg/L,是原始菌株阿維霉素產(chǎn)量的2倍以上。李悅明等[25]對產(chǎn)二十碳五烯酸(EPA)的微擬球藻(Nannochloropsis)進(jìn)行了重離子輻照,在聯(lián)合三氯生誘變的條件下得到了突變株M44,其EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.3%,是出發(fā)藻株的2.38倍。

1.2.4 ARTP誘變

ARTP技術(shù)是指能夠在大氣壓下產(chǎn)生具有高活性粒子(包括處于激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子和OH自由基等)、溫度在25～40 ℃等離子體射流,可直接改變DNA的分子結(jié)構(gòu),造成DNA損傷,引起DNA顛換、轉(zhuǎn)換和缺失等[26-27]。張奎普等[28]以鹽霉素產(chǎn)生菌白色鏈霉菌(StreptomycesalbusS12)為出發(fā)菌株,在ARTP源功率100 W、氣流功率10 L/min、發(fā)射源和之間的距離載體直徑2.5 mm,等離子體溫度28 ℃條件下誘變360 s,結(jié)合核糖體工程后鹽霉素產(chǎn)量是原始菌株的2倍以上。鮑海燕[29]對爪曲霉(Aspergillusunguis)DLEP2008001進(jìn)行等離子誘變后得到突變菌株6-20-6并進(jìn)行了10 L的規(guī)模發(fā)酵,經(jīng)過提取分離后得到6個化合物,均為縮酚酸環(huán)醚類化合物,且具有中等的抗菌活性。表明等離子誘變技術(shù)可以刺激菌株產(chǎn)生更多具有新穎結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物,作為藥物研發(fā)的先導(dǎo)化合物。祝金山等[30]對產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)QJVB-1進(jìn)行ARTP誘變處理,在注入氣體為氦氣,電源功率200 W,氣流量10 L/min,照射距離2 mm,樣品量10 μL,處理時間為140 s的條件下得到一株核黃素產(chǎn)量高、遺傳性狀穩(wěn)定的突變株QJVB-2-91,該突變株核黃素最高產(chǎn)量達(dá)到9 447 mg/L,較出發(fā)菌株提高16.8%,發(fā)酵周期縮短6 h。與傳統(tǒng)的誘變方法相比,ARTP技術(shù)能夠?qū)z傳物質(zhì)造成多樣性損傷,且易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株。

綜上所述,傳統(tǒng)的物理誘變育種技術(shù)由于其設(shè)備簡單、操作方便和等因素被廣泛運(yùn)用于誘變育種中,然而傳統(tǒng)的物理誘變技術(shù)由于突變的隨機(jī)性導(dǎo)致正突變率較低,且突變方向難以掌握,篩選工作量大,所以有一定的局限性。新型物理誘變技術(shù)的出現(xiàn),如離子輻照、微波誘變和大氣等離子體輻射等,為工業(yè)微生物育種工作開辟了新的方向。物理誘變技術(shù)能夠在較短時間內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)的突變株,創(chuàng)造出新的基因類型,為基因工程改造工業(yè)化菌株提供廣闊前景。

2 化學(xué)誘變

微生物的化學(xué)誘變育種是采用化學(xué)試劑作為誘變劑處理微生物體,來誘發(fā)遺傳物質(zhì)發(fā)生突變,在對突變體進(jìn)行篩選、育種后得到高產(chǎn)突變體的誘變方法。

2.1 堿基類似物誘變

堿基類似物是與DNA中的嘌呤類和嘧啶類堿基相似的化合物,能在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的時候代替正常的堿基進(jìn)行互補(bǔ)配對而產(chǎn)生突變。

2.2 烷化劑誘變

亞硝基胍(NTG)是一種使用廣泛、有效的烷化劑,也有超級誘變劑之稱,可以引起多位點(diǎn)的突變。NTG極易取代DNA分子中的氫原子,使DNA分子上的堿基和磷酸被烷基化,從而引起DNA復(fù)制時的堿基對配對錯誤。常用的烷化劑有亞硝基胍(NTG)、乙基硫酸甲烷(EMS)、硫酸二乙酯(DES)和乙烯亞胺等。熊志等[31]用NTG法對普伐他汀產(chǎn)生菌馬杜拉放線菌(Actinomadurasp.)進(jìn)行化學(xué)誘變處理,在NTG最佳誘變劑量0.4 mg/mL處理30 min后,經(jīng)過篩選得到一株P(guān)-N87的突變株,普伐他汀的產(chǎn)量比初始菌株高47%。韓鵬杰等[32]以海綿共生真菌(Emericellavariecolor)XSA-07-2為出發(fā)菌株,在DES質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%下誘變24 h,得到陽性突變株M8,激活了菌株的沉默基因,得到了3個新穎的聚酮類化合物。

2.3 移碼誘變劑誘變

移碼誘變劑的作用機(jī)制是與DNA相互結(jié)合引起堿基缺失或增添而引起突變。它們主要包括ICR-191、吖啶黃、ICR-171和吖啶橙等。王世梅等[33]對阿扎霉素B產(chǎn)生菌(Strepto-myceshygroscopicus)吸水鏈霉菌NND-52菌株進(jìn)行誘變處理,發(fā)現(xiàn)用吖啶橙處理菌株效果特別好,吖啶橙處理劑量大于5 mg/L時致死率超過80%,故以吖啶橙的質(zhì)量濃度3 mg/L作為誘變處理劑量,得到了一株產(chǎn)量達(dá)到1 100 mg/L,比出發(fā)菌株提高3倍以上的穩(wěn)定突變株。

綜上所述,化學(xué)誘變法的優(yōu)點(diǎn)是只需要簡單的設(shè)備和少量的藥劑,是一種較為簡便的育種技術(shù)?；瘜W(xué)誘變的機(jī)制與輻射誘變有很大不同,輻射誘變?nèi)旧w突變范圍廣,而化學(xué)誘變是作用于基因的點(diǎn)突變,更便于研究生物合成機(jī)制?；瘜W(xué)突變中有許多突變試劑(如一些烷化劑NTG和EMS),大多數(shù)是致癌試劑或者劇毒性,這為化學(xué)誘變帶來了很大的局限性,因?yàn)榉磸?fù)使用單一化學(xué)誘變劑會使突變率降低,突變譜變窄,所以化學(xué)誘變一般與其他誘變手段進(jìn)行復(fù)合誘變,誘變效果如表1所示。

表1 不同菌株選擇不同誘變劑的誘變效果

3 生物誘變法

生物誘變法是指特定的寡核苷酸在突變技術(shù)中起著介導(dǎo)作用,使基因成為一種新的分子水平的生物誘變劑?；蛘T變劑可以是特定的噬菌體和DNA轉(zhuǎn)座子,可以引起DNA的缺失、重復(fù)和插入等突變。生物誘變隨著蛋白質(zhì)工程的發(fā)展在誘變體系中占據(jù)越來越重要的地位,生物誘變根據(jù)是否對特定的基因位點(diǎn)產(chǎn)生作用可分為非定點(diǎn)誘變和定點(diǎn)誘變。

3.1 非定點(diǎn)突變

3.1.1 基因組重排技術(shù)

基因組重排技術(shù)是一種能夠有效構(gòu)建高產(chǎn)菌株的育種技術(shù)如圖1所示。在此過程中,通過紫外、ARTP和微波等技術(shù)誘變后篩選得到改良菌株,再通過原生質(zhì)體同源重組融合,選擇改良后代進(jìn)行下一輪重組,多輪重復(fù)后以期獲得高產(chǎn)菌株[34]。目前,對大多數(shù)微生物的次級代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制不了解,因?yàn)榛蚪M重排技術(shù)是建立在細(xì)胞內(nèi)整套基因組中,所以不需要了解微生物的生物合成機(jī)制,就可以對次級代謝產(chǎn)物基因組背景不明確的微生物進(jìn)行遺傳育種。研究表明:該技術(shù)篩選高產(chǎn)菌株的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù),節(jié)約了人力資源,方便運(yùn)用到工業(yè)微生物的育種工作中。徐波等[35]對替考游動放線菌吉安變種(Actinoplanesteichomyceticusvar.jianensis)SIIA01-11-25菌株進(jìn)行了基因重組研究,以期望能提高其次級代謝產(chǎn)物藥用替考拉寧的產(chǎn)量。首先對菌株進(jìn)行了(UV+NTG)復(fù)合誘變處理后得到4株親本菌株,再將其進(jìn)行3輪基因組重排后篩選到SⅡA05-3-136的高產(chǎn)菌株,其次級代謝產(chǎn)物替考拉寧產(chǎn)量從原始株的1 825 mg/L增長到3 016 mg/L,效價提高了65.3%。用傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)要達(dá)到此目標(biāo),通常耗時3～4年,而用基因重排技術(shù)僅耗時1年,大幅度減少了工作量和工作時間,提高了育種的效率。

圖1 基因組重排技術(shù)原理示意圖

3.1.2 核糖體工程

Ochi等[36]研究發(fā)現(xiàn):核糖體能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程中調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控微生物的次級代謝,使微生物產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量發(fā)生明顯改變。核糖體是合成蛋白質(zhì)的器官,在微生物的穩(wěn)定生長期時,與次級代謝產(chǎn)物的生物合成相關(guān)的基因表達(dá)大量取決于此時的核糖體功能。微生物的核糖體在經(jīng)過修飾突變后能夠直接或間接影響微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,或激活微生物體內(nèi)的沉默基因簇使其產(chǎn)生新的生物活性的物質(zhì)。這一系列過程被稱為“核糖體工程”(圖2),是一種微生物育種的新方法。核糖體工程中常用與抗性篩選的抗生素主要有鏈霉素(Str)、林肯霉素(Lin)、遺傳霉素(Gnt)、利福平(Rif)和慶大霉素(Gen)等。Zhang等[37]對深海來源的索馬里鏈霉菌SCSIO ZH66進(jìn)行核糖體工程,以激活隱藏基因簇的表達(dá)。由此用300 mg/L利福平獲得了抗性菌株ZH66-RIF1,其在MS平板上積累了具有細(xì)胞毒性的褐色色素,而在野生型菌株中不存在。經(jīng)過發(fā)酵條件的篩選,該色素化合物被純化并鑒定為抗癌藥物先導(dǎo)物弗雷德霉素(FDM)A,表明菌株ZH66-RIF1通過核糖體工程后發(fā)生了一個隱蔽的FDM A生物合成基因簇的激活。Zhuang等[38]通過鏈霉素誘導(dǎo)的方法對鏈霉菌(Streptomycessp.)CB03234進(jìn)行誘變,在20 mg/L的鏈霉素誘導(dǎo)下得到了突變體S-60-16的,產(chǎn)物天賜米星(Tiancimycin-A)產(chǎn)量從0.3 mg/L提高到(13.7±0.3)mg/L,產(chǎn)物天賜米星(Tiancimycin-D)產(chǎn)量則由原來的微量顯著增加到(19.2±0.4)mg/L,兩者總體效價提高了109倍之多。李芹等[39]以高產(chǎn)ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株(S.albulus)M-Z18為出發(fā)菌株,對其首先進(jìn)行低濃度鏈霉素(1-5MIC)抗性菌株篩選,將M-Z18的ε-PL的搖瓶產(chǎn)量從1.6 g/L提高到2.43 g/L;隨后進(jìn)行高濃度鏈霉素(5-10MIC)篩選,獲得一株高產(chǎn)突變菌SS-19,其ε-PL產(chǎn)量為3.13 g/L,較出發(fā)菌株提高了95.36%。

圖2 核糖體工程激活細(xì)胞功能示意圖

3.2 定點(diǎn)突變

自1982年Zoller和Smith的寡核昔酸誘導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法發(fā)表后,以此方法為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)的方法如雨后春筍般產(chǎn)生,這些定點(diǎn)突變方法雖然使突變效率得到了很大的提高,大大推進(jìn)了微生物誘變育種的發(fā)展,但是定點(diǎn)突變法只適用于基因序列已清楚、蛋白質(zhì)3維結(jié)構(gòu)已弄清和蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系比較清楚的基因。

3.2.1 Kunkel法定點(diǎn)突變

Kunkel法是1985年Kunkel[40]發(fā)明的一種寡核苷酸引物的一種誘變方法,原理是利用了一種對尿嘧啶取代的DNA的選擇作用,將復(fù)制型的M13噬菌體轉(zhuǎn)染到脫氧尿苷三磷酸酶和尿嘧啶脫糖苷酶雙缺陷的大腸桿菌(dut-,ung-)菌株中生長,使DNA中的T被U取代。其中帶U的就是DNA模板,用帶突變堿基的寡核苷酸引物進(jìn)行復(fù)制,從而產(chǎn)生異源雙鏈。將此雙鏈轉(zhuǎn)化到含尿嘧啶脫糖苷酶的菌株中生長,由此來破壞含U的DNA模板鏈,從而使子代DNA鏈中大部分(80%)都含突變堿基序列。

王賢舜等[41]用Kunkel法,對枯草桿菌蛋白酶E進(jìn)行定點(diǎn)誘變來提高蛋白酶E的抗氧化性,構(gòu)建了工程菌PW8888,蛋白酶E的活性大幅提高,在過氧化氫濃度1 mol/L的溶液中,25 ℃保溫14 h,酶活性仍然為原酶的95%以上,而野生型菌株蛋白酶E在過氧化氫濃度1 mol/L的溶液中,25 ℃保溫30 s,酶活性就下降到原酶的68%,2 min后只有原酶的20%。

3.2.2 CRISPR系統(tǒng)基因編輯技術(shù)

CRISPR系統(tǒng)是指在細(xì)菌及古菌中被發(fā)現(xiàn)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),其工作原理(圖3):當(dāng)外源DNA入侵時,CRISPR會在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控啟動下被轉(zhuǎn)錄為RNA前體,在體內(nèi)酶的作用下被加工成成熟的crRNA,最終與外源DNA識別結(jié)合并發(fā)揮剪切作用[42]。

圖3 Crispr Cas9系統(tǒng)工作原理

該系統(tǒng)可以識別靶向序列而完成DNA的雙鏈切割被改造為基因編輯工具,其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其特異性強(qiáng)、效率高和設(shè)計(jì)簡單等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在基因編輯技術(shù)中,徹底改變了基因組工程領(lǐng)域。中國科學(xué)院Liu等[43]已將該技術(shù)應(yīng)用到產(chǎn)纖維素酶的兩株真菌M.yceliophthorathermophila和M.heterothallica中,并用于嗜熱支原體和異種支原體的高效多重基因組構(gòu)建。該CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過NHEJ介導(dǎo)有效的突變基因組中導(dǎo)入的AMDS基因,選擇纖維素酶產(chǎn)生途徑的基因cre-1,res-1,gh1-1和alp-1作為編輯目標(biāo),通過新霉素選擇標(biāo)記整合,實(shí)現(xiàn)了4個不同位點(diǎn)的多基因同時中斷。利用該技術(shù)獲得了多株高產(chǎn)纖維素酶的菌株,且胞外分泌蛋白和木質(zhì)纖維素酶活性較原始菌株分別提高了5倍和13倍。Toru等[44]對絲狀真菌鏈孢霉(Neurosporacrassa)展開了研究,在模式生物脈孢菌中運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了有效基因的替換,利用Cas9內(nèi)切酶和單個crRNA:tracrRNA嵌合引導(dǎo)RNA,發(fā)現(xiàn)用β-微管蛋白啟動子代替內(nèi)源性clr-2啟動子能夠顯著增加多種纖維素酶的表達(dá)。研究表明:CRISPR/Cas9系統(tǒng)對生物脈孢菌有效,可能適用于自然分離的脈孢菌和其他絲狀真菌。

CRISPR系統(tǒng)在飛速發(fā)展的同時該系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)也是一個不容忽視的問題,造成脫靶效應(yīng)主要是由于核酸酶的結(jié)構(gòu)、靶基因的復(fù)雜性[45],可以通過改造系統(tǒng)元件或改用不同的策略方法增加CRISPR系統(tǒng)基因編輯的特異性。

3.2.3 基因過表達(dá)

基因過表達(dá)是指將某個基因大量表達(dá)的過程,基因過表達(dá)可以在原生細(xì)胞中,也可以在其他表達(dá)系統(tǒng)中,如可以在大腸、酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。通過基因過表達(dá)提高產(chǎn)物的基本原理是在目的基因的上游加入調(diào)控基因,使目的基因?qū)崿F(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而提高目的基因調(diào)控的次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。徐冬梅等[46]以傳統(tǒng)誘變后的菌株(S.hygroscopicus)17-1為研究對象,通過過表達(dá)雷帕霉素的正調(diào)控基因RapG成功構(gòu)建(S.hygroscopicus)17-G,雷帕霉素的產(chǎn)量提高了40%,為其他使用過表達(dá)正調(diào)控基因提高產(chǎn)量的工作提供了參考。

綜上所述,定點(diǎn)突變對于基因序列明確、次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑明確的生物體有著不可否認(rèn)的作用,能夠在短時間內(nèi)得到高產(chǎn)菌株,比傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變技術(shù)省時省力,能夠通過定點(diǎn)突變有目的性地改變遺傳物質(zhì),得到理想產(chǎn)物的菌株?；蛐蛄忻鞔_、次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑明確的藥用微生物只占小部分比例,大部分藥用微生物的基因序列未明確,這時就無法使用定點(diǎn)突變的手段來進(jìn)行誘變處理,可以選擇基因重排、核糖體工程這些非定位突變的手段來改造菌株。

4 復(fù)合誘變

菌株在長時間使用同一種誘變劑后會出現(xiàn)誘變劑疲勞效應(yīng),還會造成菌株的生長周期延長、孢子數(shù)量下降和突變譜變窄等問題,這些問題在實(shí)際誘變中常使用復(fù)合誘變的方法來避免。復(fù)合誘變有兩種方法:一種是誘變劑重復(fù)使用兩次或兩次以上,另一種是兩種或兩種以上誘變劑同時使用。普遍認(rèn)為,復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng),誘變效果比單一誘變因子誘變好。

鄧新云等[47]對黑曲霉YZ-35菌株進(jìn)行了紫外誘變與硫酸二乙酯(DES)復(fù)合誘變研究,得到了一株檸檬酸高產(chǎn)菌株YZ-DE-3,檸檬酸產(chǎn)量較原始菌株提高了50.23%,進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析后表明突變體產(chǎn)酸遺傳特性穩(wěn)定。游玟娟等[48]以紅曲霉(Monascussp.3.00567)為出發(fā)菌株,進(jìn)行了(UV+DES)復(fù)合誘變處理,最終得到一株穩(wěn)定高產(chǎn)菌株(Monascussp.)UV-D-9,洛伐他汀產(chǎn)量達(dá)到(2 890±20)mg/L,相對于出發(fā)菌株提高了82.9%,有良好的工業(yè)化價值。焦雪茜等[49]通過對根癌土壤桿菌(Rhizobiumradiobacter)進(jìn)行紫外誘變結(jié)合離子束誘變選育輔酶Q10的高產(chǎn)菌株,結(jié)合抗性篩選獲得高產(chǎn)菌株Y80-58-23,其菌株的輔酶Q10產(chǎn)量穩(wěn)定,與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了66.1%,達(dá)到了105.8 mg/L。張奎普等[28]比較了單因素誘變法和復(fù)合誘變法對鹽霉素產(chǎn)生菌白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)S12的效果。S12菌株在距離254 nm的紫外燈12 cm處照射6 min后得到突變株,正突變率僅有3%,得到的最高效價是(26.0±1.8)mg/L,僅比原始菌株提高30%。后續(xù)又通過將紫外誘變和核糖體工程相結(jié)合,對S12菌株進(jìn)行復(fù)合誘變,得到了一株具有四環(huán)素和氯霉素抗性的突變株,搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到34 712 mg/L,是親本菌株的2倍以上。王靚[50]通過ARTP和基因重排技術(shù)復(fù)合誘變L-聚賴氨酸產(chǎn)生菌,最后篩選出了一株高產(chǎn)菌GSG-1,ε-LP的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到3.56 g/L,較原始菌株G67提高了87.3%,通過誘變育種技術(shù)得到突變株后對L-聚賴氨酸的生物合成途徑進(jìn)行了初探。通過對高產(chǎn)菌株GSG-1和原始菌株G67基因測序分析對比后初步解析了GSG-1的高產(chǎn)機(jī)制:GSG-1對比原始菌株缺少了葡萄糖脫氫酶基因(EC1.1.1.47)、乙酰-CoA連接酶基因(EC6.2.1.13)、L-Lys氨基變位酶基因(EC5.4.3.2)和L-Lys 6-氨基轉(zhuǎn)移酶基因(EC2.6.1.36)。以上基因的缺失增大了GSG-1菌株中TCA循環(huán)通量,副產(chǎn)物合成量減少,L-聚賴氨酸的前體L-Lys分解途徑減弱,從而增加L-聚賴氨酸的產(chǎn)量。

綜上所述,復(fù)合誘變在實(shí)際操作當(dāng)中運(yùn)用非常廣泛,因?yàn)榛瘜W(xué)誘變等誘變劑反復(fù)使用,導(dǎo)致突變譜變窄、突變率降低,長期使用難以得到性狀優(yōu)異的突變株,研究者通常以首先使用單因素誘變后再用復(fù)合誘變的方式來提高菌株的突變率,且大部分復(fù)合誘變的正突變率和效價提高率均大于單因素誘變。

5 結(jié) 論

微生物誘變育種技術(shù)已成為提高其次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量的有效技術(shù)手段,且在工業(yè)化育種實(shí)踐中得到了廣泛運(yùn)用。然而,大部分藥用微生物的誘變機(jī)理研究還不深入,育種工作還存在較大的盲目性。同時,傳統(tǒng)誘變手段如紫外誘變、化學(xué)誘變均有一定的局限性,如誘變源單一反復(fù)使用往往導(dǎo)致正突變率降低,誘變菌株不穩(wěn)定、突變譜變窄和菌株對誘變劑敏感度降低等,這些問題導(dǎo)致微生物先導(dǎo)物規(guī)模化制備產(chǎn)品質(zhì)量不一致,嚴(yán)重限制其藥物開發(fā)與臨床應(yīng)用。隨著基因測序工程和蛋白質(zhì)工程的快速發(fā)展,越來越多的藥用微生物基因組序列被闡明,其先導(dǎo)物生物合成相關(guān)基因功能被驗(yàn)證,先導(dǎo)物生物合成路線越來越清晰,這為有目的誘變育種提供了很大支持。因此,利用生物信息技術(shù)、基因組和蛋白質(zhì)組技術(shù),結(jié)合傳統(tǒng)誘變手段改造藥用微生物,可以更有效地誘變育種,獲得高產(chǎn)、穩(wěn)定和優(yōu)質(zhì)的工業(yè)菌株。