宮腔粘連大鼠模型的構(gòu)建以及二甲雙胍對模型大鼠生育能力的改善作用▲

江 梅 姜經(jīng)航 邵 帥 王 洋 丁 濤

(湖北省荊門市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，荊門市 448000，電子郵箱：124558444@qq.com)

宮腔粘連是人工流產(chǎn)、診斷性刮宮等宮腔操作的常見并發(fā)癥，可導(dǎo)致繼發(fā)不孕和反復(fù)流產(chǎn)[1]。病理學(xué)研究結(jié)果表明子宮內(nèi)膜纖維化參與宮腔粘連形成，可有效降低子宮內(nèi)膜纖維化程度或有助于治療宮腔粘連[2-3]。二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線用藥。研究顯示，二甲雙胍通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)促使細胞外基質(zhì)合成的相關(guān)蛋白表達下調(diào)，從而發(fā)揮抗纖維化的效應(yīng)[4]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)將二甲雙胍應(yīng)用于治療宮腔粘連的研究報道。本研究通過構(gòu)建大鼠宮腔粘連模型，觀察口服二甲雙胍在促進子宮內(nèi)膜修復(fù)、恢復(fù)生育能力方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周性成熟雌性SD大鼠45只，體重150～200 g，9～10周性成熟雄性SD大鼠15只，體重400～530 g，購于湖北省實驗動物中心(SCXK2015-0018)。飼養(yǎng)條件：普通級別，自然光線，室溫維持在24℃～26℃，定期消毒。

1.2 主要試劑及儀器 TGF-β1抗體、Smad 3抗體、纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)抗體、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)抗體以及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)、二抗均購于英國Abcam公司(批號分別為：ab215715、ab95455、ab2413、ab32575、ab181603、ab205719)，含蛋白酶抑制劑的裂解液(批號：P0013B)、DC蛋白鑒定試劑盒(批號：P10012S)均購自碧云天公司， TRIzol試劑購于美國Thermo公司(批號：1218355)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：639547)、PCR試劑盒(批號：RR037A)以及TGF-β1、Smad 3、FN、α-SMA、內(nèi)參GAPDH基因引物(見表1)均購自大連Takara公司。SMZ800N型倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，ABI7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，041BR128118型雙向電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

表1 引物序列

1.3 實驗方法

1.3.1 刮宮聯(lián)合感染法構(gòu)建宮腔粘連大鼠模型：取30只SD雌性大鼠，采用隨機數(shù)字表法將其分為對照組和造模組各15只。使用1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg)腹腔注射，麻醉成功后將SD大鼠固定于手術(shù)臺上。于造模組大鼠宮頸上方約5 mm處作縱行切口，長度約4 mm，采用自制大鼠宮腔刮勺經(jīng)宮頸上方切口行刮宮術(shù)，待宮腔四壁出現(xiàn)粗糙感時停止刮宮；將浸泡于10 mg/mL脂多糖生理鹽水24 h后的棉線分別置于左側(cè)及右側(cè)宮腔，并將棉線穿過腹部切口固定于皮膚，逐層關(guān)腹，48 h后抽出宮腔置留線。對照組僅行腹部切口、開腹及關(guān)腹手術(shù)，不對宮腔進行任何操作。大鼠蘇醒后繼續(xù)飼養(yǎng)。術(shù)后給予大鼠肌肉注射青霉素20萬IU/d，1次/d，連續(xù)3 d。分別于術(shù)后第7天、第14天以及第21天，使用1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg)麻醉后采用頸椎快速脫臼法處死各組大鼠各5只，切開下腹部，暴露并切除子宮；將每只大鼠子宮組織分為2份，1份標本常規(guī)4%甲醛固定、石蠟包埋，另1份使用液氮冷凍。

1.3.2 蘇木素-伊紅染色：石蠟切片在二甲苯Ⅰ中脫蠟20 min后放入二甲苯Ⅱ中脫蠟20 min；脫蠟后的切片依次浸入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、75%乙醇及自來水中各浸泡5 min；蘇木精染色3 min；1%鹽酸酒精分化片刻，自來水沖洗 1 min；1%氨水返藍,自來水沖洗1 min；伊紅染色5 min，自來水洗去多余的染液；依次通過 75%乙醇5 s，95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ和 100%乙醇Ⅱ脫水各5 min；在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分別浸泡20 min；中性樹膠封固，晾干保存。于高倍顯微鏡下觀察，每份子宮組織選取5個視野，計數(shù)大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量，取5個視野的平均值作為大鼠子宮內(nèi)膜腺體計數(shù)。用Image-ProPlus 6.0軟件測量切片子宮內(nèi)膜厚度(子宮內(nèi)膜肌層交接處至宮腔的垂直距離)，取5個視野的平均值作為子宮內(nèi)膜厚度。

1.3.3 Masson染色：石蠟切片脫蠟、水化，Masson復(fù)合染液染色，2%醋酸水溶液稍洗，5%磷鎢酸分化5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸片刻，亮綠染色液5 min，0.2%醋酸水洗片刻2次，無水乙醇脫水10 s，二甲苯透明2 min，中性樹膠封固。于高倍顯微鏡下觀察，每份子宮組織選取5個視野，計算大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積所占子宮內(nèi)膜面積的比例，取5個視野的平均值。

1.3.4 免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白質(zhì)的表達：待檢測的組織用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗后，用含蛋白酶抑制劑的裂解液進行裂解，使用DC蛋白鑒定試劑盒測定蛋白含量，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜到纖維尼綸膜上。使用5%蛋白封閉液室溫封閉3 h。阻斷非特異的結(jié)合位點后，加入抗TGF-β1(1 ∶1 000)、Smad 3(1 ∶5 000)、FN(1 ∶5 000)、α-SMA(1 ∶1 500)和GAPDH(1 ∶10 000)的抗體在4℃孵育過夜，洗膜后用過氧化物酶連接的二抗(Abcam公司，ab205719)孵育1.5 h后，用增強化學(xué)發(fā)光發(fā)顯示蛋白帶，然后檢測灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次。采用Image Lab 5.0圖像分析軟件計算目的蛋白的相對表達量。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達：使用TRIzol試劑盒提取子宮組織總RNA，紫外分光光度法測定RNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。按照試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系(冰上配制)共20 μL，包括SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μL、上游引物(10 μM)0.8 μL、下游因素(10 μM)0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、DNA模板2.0 μL、dH2O(滅菌蒸餾水)6.0 μL。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，50℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算TGF-β1、Smad 3、FN、α-SMA的mRNA相對表達量。

1.3.6 二甲雙胍對宮腔粘連大鼠生育能力的影響：取另15只SD雌性大鼠，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為對照組、造模組、造模+二甲雙胍組各5只。按照1.3.1中的步驟，對造模組、造模+二甲雙胍組大鼠進行造模，對照組僅行腹部切口、開腹及關(guān)腹手術(shù)，不對宮腔進行任何操作。造模14 d后，造模+二甲雙胍組開始給予二甲雙胍300 mg/(kg·d)灌胃，對照組和造模組給予同等劑量的生理鹽水灌胃，均為1次/d，連續(xù)服用4周。服藥4周后，根據(jù)動情周期分別將這15只雌性大鼠和15只雄性大鼠按照1 ∶1比例合籠，次日早晨檢查陰道栓，有陰道栓為交配成功，計為妊娠0.5 d。于13.5 d后處死大鼠，評估和記錄雌性大鼠的孕囊數(shù)，其中未孕子宮為白色且呈線狀，而妊娠子宮則呈管狀，含有胚胎的部分則更膨大。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組設(shè)計t檢驗，多組之間及組內(nèi)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組和造模組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量的比較 隨著造模時間的延長造模組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量呈下降趨勢，且各時間點的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量均少于對照組(均P<0.05)，見表2。

表2 對照組和造模組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量的比較 (x±s，個)

2.2 對照組和造模組子宮內(nèi)膜厚度的比較 隨著造模時間的延長造模組子宮內(nèi)膜厚度呈變薄趨勢，且各時間點的子宮內(nèi)膜厚度均薄于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 對照組和造模組子宮內(nèi)膜厚度的比較(x±s,nm)

2.3 對照組和造模組子宮內(nèi)膜纖維化面積百分比的比較 隨著造模時間的延長造模組子宮內(nèi)膜內(nèi)膜纖維化面積百分比呈增加趨勢，且各時間點的百分比均大于對照組(均P<0.05)，見表4。

表4 對照組和造模組子宮內(nèi)膜纖維化面積百分比的比較(x±s，%)

2.4 對照組和造模組子宮組織TGF-β1、Smad 3、FN以及a-SMA mRNA表達量的比較 與對照組比較，造模組各時間點子宮內(nèi)膜組織TGF-β1、Smad 3、FN以及α-SMA的mRNA相對表達水平均上調(diào)，且隨著造模時間的延長相對表達量均呈上升趨勢(均P<0.05)，見表5。

表5 對照組和造模組子宮內(nèi)膜TGF-β1 、Smad 3、FN以及α-SMA mRNA的相對表達水平的比較(x±s)

組別nFN mRNA 第7天第14天第21天F值P值α-SMA mRNA 第7天第14天第21天F值P值對照組5 1.00±0.011.00±0.021.00±0.010.6500.5551.01±0.011.00±0.011.00±0.01 1.000 0.420造模組51.79±0.253.04±0.07a4.42±0.38ab16.4580.0042.00±0.033.09±0.11a4.11±0.15ab251.537<0.001 t值6.32853.81618.18275.28337.50941.467P值0.008<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.5 對照組和造模組子宮內(nèi)膜組織TGF-β1、Smad 3、FN以及α-SMA蛋白的表達量的比較 與對照組比較，造模組各時間點子宮內(nèi)膜組織TGF-β1、Smad 3、FN以及α-SMA蛋白的相對表達水平均升高(均P<0.05)；并且隨著造模時間的延長，造模組TGF-β1以及Smad 3蛋白的相對表達水平呈上升趨勢(均P<0.05)，但造模第21天的FN以及α-SMA蛋白的表達水平與第14天比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表6及圖2。

表6 對照組和造模組子宮內(nèi)膜TGF-β1 、Smad 3、FN以及α-SMA 蛋白的相對表達水平的比較(x±s)

組別nFN 蛋白 第7天第14天第21天F值P值α-SMA 蛋白 第7天第14天第21天F值P值對照組5 1.351±0.0711.449±0.0391.347±0.0244.208 0.0720.885±0.0290.911±0.0541.040±0.157 2.1760.195造模組56.576±0.1969.129±0.454a8.392±0.161a57.566<0.0011.232±0.0802.800±0.150a3.468±0.275a113.268<0.001 t值43.46929.22174.9767.07920.49013.261P值<0.0010.001<0.0010.002<0.0010.001

圖2 對照組和造模組大鼠各時間點子宮內(nèi)膜組織TGF-β1、Smad 3、FN以及α-SMA蛋白的表達情況

2.6 3組大鼠子宮內(nèi)孕囊數(shù)的比較 經(jīng)檢查，所有的SD雌性大鼠合籠后均可見陰道黏液栓，說明交配成功。對照組、造模+二甲雙胍組、造模組大鼠的子宮內(nèi)孕囊數(shù)依次降低(均P<0.05)，見表7。

表7 3組大鼠子宮內(nèi)孕囊數(shù)的比較(x±s，個)

3 討 論

宮腔粘連又被稱為Asherman綜合征，目前認為其發(fā)生主要與宮腔內(nèi)操作、宮腔內(nèi)感染等因素有關(guān)。此外，細胞因子打破細胞外基質(zhì)合成與降解的平衡，也會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜纖維化并促進粘連形成[5]。本研究采用搔刮宮腔法結(jié)合脂多糖制造感染性因素，構(gòu)建大鼠宮腔粘連模型。結(jié)果顯示，與對照組大鼠比較，造模組大鼠的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜變薄，纖維化程度加重(P<0.05)；并且隨著造模時間的延長，造模組大鼠的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量減少、子宮內(nèi)膜厚度變薄以及纖維化程度均加重。這提示大鼠宮腔粘連模型構(gòu)建成功，該建模方法操作簡單，對內(nèi)膜損傷明顯，模型相對穩(wěn)定。

病理學(xué)研究表明，細胞外基質(zhì)纖維蛋白原聚集可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)纖維化，而TGF-β1是目前引起器官纖維化最重要的細胞因子之一，其在子宮內(nèi)膜中呈現(xiàn)高表達，導(dǎo)致TGF-β/Smad信號通路被激活，進而能夠激活下游促纖維化蛋白的表達，加重細胞外基質(zhì)的堆積，促進纖維化加重[6-8]。因此，在本研究中，宮腔粘連大鼠子宮組織的TGF-β1、Smad 3、FN及α-SMA的基因和蛋白水平均呈高表達，并且隨著造模時間的延長，TGF-β1以及Smad 3的相對表達量也隨之上升(P<0.05)，但是在造模第21天的FN和α-SMA蛋白的表達水平與第14天比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

宮腔粘連最為嚴重的后果是繼發(fā)不孕和反復(fù)流產(chǎn)。目前，針對宮腔粘連主要采取以手術(shù)為主的綜合性治療，包括激素調(diào)節(jié)治療聯(lián)合宮腔內(nèi)放置節(jié)育器、球囊、防粘連劑，或者經(jīng)血干細胞宮腔灌注[9-10]，但是仍存在復(fù)發(fā)率高、妊娠情況改善不明顯的缺點[11]。在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠通過抑制TGF-β1/Smad信號通路降低肝臟纖維化程度[12]。故我們認為，二甲雙胍有可能通過抑制TGF-β1/Smad 3來改善大鼠宮腔纖維化程度，進而影響大鼠的生育力。本研究結(jié)果顯示，造模+二甲雙胍組和造模組大鼠孕囊數(shù)量少于對照組，但造模+二甲雙胍組的數(shù)量均多于造模組(均P<0.05)，這表明二甲雙胍能夠在一定程度上改善宮腔粘連大鼠的生育能力。

綜上所述，刮宮聯(lián)合感染法能夠構(gòu)建穩(wěn)定的宮腔粘連大鼠模型，為后續(xù)進行相關(guān)機制研究提供了動物模型；同時，二甲雙胍能夠改善宮腔粘連大鼠的生育能力。