葒草素通過(guò)激活PGC－1β 發(fā)揮抗糖尿病心肌病作用

王 倩，林文娟，王 娜，張 冰

糖尿病增加了患心臟病的風(fēng)險(xiǎn)，50%的糖尿病患者死于心血管疾?。?］。炎癥和氧化應(yīng)激激活是糖尿病心肌損傷顯著的病理生理過(guò)程，也會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量調(diào)控障礙，目前仍亟待探索有效的藥物和分子靶點(diǎn)來(lái)控制糖尿病心肌病的發(fā)展［1－2］。糖尿病患者的心力衰竭發(fā)病率非常高，而且糖尿病患者的預(yù)后比非糖尿病患者更差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，多種機(jī)制導(dǎo)致糖尿病患者收縮期和舒張期功能受損，這些患者的心臟衰竭與冠狀動(dòng)脈疾病或相關(guān)危險(xiǎn)因素?zé)o關(guān)［3］。

葒草素（Orientin）是從天然植物中分離出來(lái)的黃酮類成分，在近幾年的研究中，葒草素已被探究證實(shí)具有豐富的細(xì)胞組織保護(hù)特性，如抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗癌和抗血栓活性［4－5］。葒草素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Toll 樣受體－4／核轉(zhuǎn)錄因子－κB／腫瘤壞死因子－α信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，從而對(duì)大鼠腦缺血／再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用［6］。近期研究證實(shí)，葒草素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶／一氧化氮（eNOS／NO）信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而能夠減輕小鼠心梗后心肌病理性重構(gòu)［7］。迄今為止，葒草素是否能對(duì)糖尿病心肌病發(fā)揮保護(hù)作用尚無(wú)研究報(bào)道。本研究將探究葒草素在糖尿病心肌病中發(fā)揮的作用及潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL／6 小鼠（20～25 g，8～10 周齡）從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得，在22～24℃的12 h的光／暗周期下被籠養(yǎng)，吃定期的顆粒飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 純度＞98%的葒草素（融禾，上海），檢測(cè)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量試劑盒（南京建城）?？筆GC－1β 的抗體（Abcam，美國(guó)），抗GAPDH 的抗體（cmcTAG 公司，美國(guó)），Trizol 試劑和RNA 提取試劑盒（天根，北京），引物合成（GenScript，南京），評(píng)價(jià)H9C2 細(xì)胞內(nèi)活性氧（reac?tive oxygen，ROS）生成的熒光探針2′，7′－二氯熒光素二乙酸酯（DCFH－DA）（碧云天，上海）。

1.3 小鼠分組及處理方式 將雄性C57 小鼠隨機(jī)分為3 組：同籠陰性小鼠分為對(duì)照組（CON 組，n ＝12）、糖尿病組（DCM 組，n ＝12）和按常規(guī)腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）50 mg／kg）誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型的外源補(bǔ)充葒草素小鼠糖尿病組（DCM＋ORI 組，n ＝12）。DCM＋ORI 組小鼠每天通過(guò)灌胃外源補(bǔ)充葒草素（溶于生理鹽水，劑量為40 mg／kg），DCM 組僅補(bǔ)充相同量的生理鹽水。喂養(yǎng)8周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 小鼠心臟超聲檢測(cè) 超聲工作者完全未知研究方案和動(dòng)物組。使用VisualStulic 770 超聲儀器進(jìn)行小鼠心臟超聲檢查，30 MHz 的傳感器記錄左胸骨旁胸腺的長(zhǎng)軸和短軸。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)的指標(biāo)包括左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）、舒張末期室間隔（intraventricular septal thickness end diastasis，IVSd）和舒張末期左室后壁（left ventricular positerior wall end diastasis，LVPWd）厚度。以上參數(shù)由Vevo Lab 3.1.0 軟件計(jì)算得出。

1.3.2 小鼠心肌組織學(xué)染色 用蘇木精－伊紅（HE）或Masson 三色染色法分別對(duì)心肌組織的其他部分進(jìn)行染色，以評(píng)估心肌細(xì)胞的橫截面積和膠原沉積。切片用數(shù)字掃描成像系統(tǒng)（Olympus FV1000，日本）進(jìn)行可視化，心肌細(xì)胞橫截面積和纖維化程度用Image J 軟件（NIH，Bethesda，MD，USA）進(jìn)行量化。

1.3.3 小鼠心肌組織MDA 和SOD 的測(cè)定 檢測(cè)心臟組織中氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA 含量和SOD 活性，步驟基于制造商的說(shuō)明。通過(guò)SpectraMax M5 裝置使用分光光度法分析數(shù)據(jù)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT－qPCR）檢測(cè)mRNA 表達(dá) 采集左心室壁部分組織，按照RNA提取試劑盒的指示從標(biāo)本（或處理后培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞）中提取總RNA。然后利用上標(biāo)第一鏈合成系統(tǒng)（Invitrogen，CA，USA）將RNA 反向轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA。用CFX96 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)C1000 熱循環(huán)儀（美國(guó)）進(jìn)行RT－qPCR。磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）是靶基因轉(zhuǎn)錄水平正?；臉?biāo)準(zhǔn)基因。本研究中使用的引物序列列于表1 中。

1.3.5 H9C2 心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 將H9C2 細(xì)胞按（1～2）×105個(gè)／ml 均勻種于六孔板中，于含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)基中置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（5% CO2、飽和濕度、37 ℃）無(wú)菌培養(yǎng)。細(xì)胞分為3：組對(duì)照組、高糖組和高糖＋葒草素組。高糖＋葒草素組同時(shí)加入葒草素生理鹽水溶液，使培養(yǎng)液中葒草素濃度為10 μmol，分別給予低糖和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后用DCFH－DA 進(jìn)行共聚焦染色，DCFH－DA 在ROS 的作用下在細(xì)胞內(nèi)脫酯化，轉(zhuǎn)化為高熒光分子2′，7′－二氯熒光素。通過(guò)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 和發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 28 的熒光強(qiáng)度測(cè)定細(xì)胞ROS 的產(chǎn)生。

1.3.6 Western－blot 檢測(cè)PGC－1β 的表達(dá) 用RI?PA 裂解緩沖液提取左心室組織和H9C2 的總蛋白。測(cè)定蛋白濃度后用10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，USA）。將5%脫脂奶粉溶解在洗膜緩沖液中（150 mmol NaCl、50 mmol Tris（pH 7.5）和0.1%吐溫－20℃封閉膜2～3 h（20～25℃）。根據(jù)分子量分離膜，在4℃下與相應(yīng)的一級(jí)抗體孵育12 h，再用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的第二抗體在20～25℃孵育2 h，加入電化學(xué)發(fā)光試劑，并使用CeimDoc XR（Bio Rad，美國(guó)）掃描印跡。對(duì)蛋白質(zhì)條帶的灰度值進(jìn)行可視化分析，以GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行處理和分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用單向ANOV A 處理，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外源補(bǔ)充葒草素顯著改善糖尿病導(dǎo)致的心功能損傷 8 周后小鼠心臟超聲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DCM 組小鼠心功能較CON 組顯著損傷，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEF 和LVFS 顯著降低，而DCM＋ORI 組能夠顯著改善小鼠心功能（圖1 A～C）。又檢測(cè)了反映心臟重構(gòu)的心肌肥厚指數(shù)之一心體比（heart weight／body weight，HW／BW），結(jié)果顯示，DCM 組小鼠心體比較CON 組顯著升高，而DCM＋ORI 組小鼠心體比較DCM 組顯著下調(diào)（圖1 D）。

2.2 外源補(bǔ)充葒草素顯著減輕糖尿病導(dǎo)致的心肌肥厚和纖維化 HE 染色結(jié)果顯示，DCM 組小鼠心肌細(xì)胞較CON 組顯著肥大，而DCM＋ORI 組能夠顯著減輕DCM 組小鼠心肌細(xì)胞病理性肥大（圖2 A 和B）。MASSON 染色結(jié)果顯示，糖尿病心肌病小鼠左室壁心肌組織纖維化較CON 組顯著加重，而DCM＋ORI 組小鼠心肌纖維化顯著減輕（圖2 C 和D）。

2.3 外源補(bǔ)充葒草素顯著減輕糖尿病小鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷 DCM 組小鼠心肌組織MDA 含量較CON 組顯著升高，SOD 含量顯著降低，而DCM＋ORI 組可以顯著減弱這種效應(yīng)（圖3 a 和b）。進(jìn)一步通過(guò)RT－qPCR 檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志物NOX2 和NOX4 的mRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示DCM 組小鼠心肌組織NOX2 和NOX4 表達(dá)量較CON 組顯著升高，而DCM＋ORI 組能夠顯著降低NOX2 和NOX4 的表達(dá)（圖3 C 和D）。

2.4 葒草素顯著減輕高糖培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷 高糖組H9C2 細(xì)胞ROS 生成量較對(duì)照組顯著升高，而DCM＋ORI 組能夠顯著減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 生成，從而減輕氧化應(yīng)激損傷（圖4）。

2.5 葒草素顯著增強(qiáng)糖尿病小鼠心肌組織和高糖培養(yǎng)H9C2 細(xì)胞PGC－1β 的表達(dá) 糖尿病小鼠心肌組織PGC－1β 的表達(dá)量較CON 組顯著降低，而DCM＋ORI 組顯著激活糖尿病小鼠心肌組織內(nèi)PGC－1β 的表達(dá)（圖5 A）。高糖培養(yǎng)下H9C2 心肌細(xì)胞內(nèi)PGC－1β 表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低，而高糖＋葒草素組心肌細(xì)胞內(nèi)PGC－1β 表達(dá)量顯著升高（圖5 B）。結(jié)果提示葒草素能夠顯著增強(qiáng)糖尿病小鼠心肌組織和高糖培養(yǎng)H9C2 細(xì)胞PGC－1β 的表達(dá)。

3 討論

近年來(lái)，由于多種中草藥被證實(shí)具有抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，成為心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［8］。葒草素就是其中之一，本研究首次證實(shí)葒草素治療能有效地抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外，最終都能阻止糖尿病心肌病小鼠心肌纖維化和心肌肥厚，改善心肌功能。在機(jī)制上，葒草素能夠通過(guò)激活心肌組織中的PGC－1β 發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而保護(hù)糖尿病心肌病小鼠心肌組織。

圖1 三組小鼠心臟超聲檢測(cè)LVEF、LVFS 和HW／BW 比較（n＝6）

圖2 三組小鼠HE、MASSON 染色及橫截?cái)嗝娣e、左室膠原蛋白量比較（n＝6）

圖3 三組小鼠MDA、SOD、NOX4 和NOX2 表達(dá)的比較（n＝6）

圖4 H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)ROS 熒光強(qiáng)度比較（n＝5）

糖尿病心肌病引起的心臟重塑的重要標(biāo)志是心肌肥厚和心肌纖維化，心肌肥厚也通過(guò)增加的心臟質(zhì)量反映。心肌纖維化和心肌細(xì)胞肥大是解釋糖尿病心肌病心臟改變的最常見(jiàn)機(jī)制。一些研究表明，糖尿病導(dǎo)致細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷、心肌收縮蛋白缺陷和膠原形成增加，導(dǎo)致心肌解剖和生理變化［9］。本研究結(jié)果顯示葒草素外源補(bǔ)充能夠顯著減輕糖尿病心肌病小鼠心肌組織肥厚和纖維化程度，提示葒草素能夠顯著改善糖尿病心肌損傷。在動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)中也有類似的發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照動(dòng)物相比，糖尿病動(dòng)物的心率、收縮壓和收縮分?jǐn)?shù)顯著降低［10］。臨床研究也提示，糖尿病與左室心肌收縮和舒張功能的附加損害獨(dú)立相關(guān)［11］。這些研究表明糖尿病是收縮功能障礙的原因之一，而本研究證實(shí)外源補(bǔ)充葒草素能夠顯著改善高糖導(dǎo)致的小鼠心功能障礙，也顯示了葒草素的心肌保護(hù)作用。

圖5 三組小鼠心肌組織和高糖培養(yǎng)H9C2 細(xì)胞PGC－1β 的表達(dá)

糖尿病心肌病的代謝異常刺激ROS 生成，如高血糖、高脂血癥和晚期糖基化終產(chǎn)物的積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激［12］。持續(xù)升高的氧化應(yīng)激狀態(tài)有過(guò)度消耗內(nèi)源性抗氧化劑的趨勢(shì)，如SOD，并伴隨著氧化應(yīng)激產(chǎn)物如MDA 在心臟中的積累［13－14］。檢測(cè)SOD、MDA 及ROS 的含量成為檢驗(yàn)細(xì)胞或組織中氧化應(yīng)激程度的重要檢測(cè)指標(biāo)［15］。為了抵抗持續(xù)氧化應(yīng)激的損害，已經(jīng)形成了一系列內(nèi)源性抗氧化機(jī)制，其中之一是過(guò)氧化體增殖活化受體γ 輔助活化受體因子（PGC－1β）［16］。PGC－ 1β 主要在心臟等氧化組織中表達(dá)，并調(diào)節(jié)線粒體的生物合成和代謝以及包含電子傳遞鏈的蛋白質(zhì)［17］。以往的研究表明，PGC－1β 在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大過(guò)程中具有良好的保護(hù)作用，通過(guò)維持葡萄糖代謝和減輕氧化應(yīng)激來(lái)抗心肌肥厚［18］。壓力超負(fù)荷下，心肌組織PGC－1β 的表達(dá)顯著降低，可導(dǎo)致心肌組織或心肌細(xì)胞ROS 生成、MDA 含量和NOX4 表達(dá)增加，SOD 活性降低，而通過(guò)激活PGC－1β 可以顯著逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)［17］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病心肌病小鼠心肌組織和高糖處理的H9C2 細(xì)胞PGC－1β 的表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)，而外源補(bǔ)充葒草素能夠顯著激活PGC－1β 的表達(dá)，提示葒草素能夠通過(guò)激活心肌細(xì)胞內(nèi)PGC－1β 的表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而減輕高糖對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。所有這些證據(jù)表明，靶向PGC－1β 可能是治療糖尿病心肌病的一種有前途的策略。葒草素前期被證實(shí)有多種藥理活性，如抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗癌和抗血栓活性［4－5］。葒草素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4／NF－κB／TNF－α 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，從而對(duì)大鼠腦缺血／再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用［6］。近期研究證實(shí)，葒草素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS／NO 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而能夠減輕小鼠心梗后心肌病理性重構(gòu)［7］。

綜上所述，本研究從在體和離體兩方面展示了葒草素對(duì)糖尿病心肌損傷的保護(hù)作用，在機(jī)制上葒草素能夠通過(guò)激活PGC－1β 的表達(dá)，進(jìn)一步減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，為糖尿病心肌病治療提供重要藥物治療靶點(diǎn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步完善和深入，以增強(qiáng)論證強(qiáng)度，為葒草素進(jìn)一步在臨床中糖尿病患者的應(yīng)用提供理論依據(jù)。