不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜建立及其抗氧化活性研究

吳孟霏，李春玲，任 河，孫玉琦

（錦州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 錦州121001）

紅花為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L．）的干燥花，是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之功效[1]。 已有研究證明，羥基紅花黃色素A(SY)是紅花的有效成分，具有抗氧化，抑制血小板聚集，改善心肌供血，抑制血栓形成等功效[2]。 近年來我國許多地方大面積種植紅花，其中新疆因其獨(dú)特的環(huán)境成為紅花主要產(chǎn)地。由于產(chǎn)地和其他因素的不同，使得不同產(chǎn)地紅花的質(zhì)量存在差異。目前《中國藥典》（2020 版）規(guī)定以紅花中SY 含量來作為評價(jià)紅花藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)[3]。中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖，它將能較為全面地反映中藥中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，同SY 的含量測定相結(jié)合，能更好的對中藥質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià)。 目前，從紅花中分離出200多種化合物，包括多炔類、黃酮、甾體類、醌式查爾酮苷類、倍半萜類，其中很多的黃酮類和醌式查爾酮苷類成分已報(bào)道具有抗氧化和清除自由基的活性[4]。DPPH 法測定紅花藥材清除自由基、抗氧化的基理是二苯基苦味肼基自由基[DPPH·]是一種穩(wěn)定的以氮原子為中心的自由基，最大吸收在515 nm 波長[5]。 [DPPH·]乙醇溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線性關(guān)系。 在[DPPH·]乙醇溶液中加入紅花抗氧化提取物后，紅花抗氧化提取物可以與[DPPH·]自由基結(jié)合或發(fā)生替代，使[DPPH·]自由基數(shù)量減少，溶液顏色變淺，表現(xiàn)為：其在515 nm 波長處的吸光度不斷減小，直至達(dá)到穩(wěn)定。 因此，可以通過在515 nm 波長處檢測紅花抗氧化提取物對[DPPH·]自由基的清除效果，考察其抗氧化活性。

本研究通過高效液相色譜法（HPLC)，對新疆塔城、新疆伊犁、新疆烏魯木齊、新疆吉木薩爾、新疆哈密、新疆伊寧、新疆昌吉、新疆阿克蘇、四川簡陽市、云南大理、河南省開封市、陜西寶雞、內(nèi)蒙古包頭、浙江東陽、甘肅蘭州15 個(gè)不同產(chǎn)地紅花藥材中SY 含量進(jìn)行測定，進(jìn)行指紋圖譜研究及紅花抗氧化活性差異的考察。

1 材料與方法

1.1 材料

供試15 個(gè)產(chǎn)地紅花分別來自新疆塔城、伊犁、烏魯木齊、吉木薩爾、哈密、伊寧、昌吉、阿克蘇，四川簡陽市，云南大理，河南開封，陜西寶雞，內(nèi)蒙古包頭，浙江東陽和甘肅蘭州。 供試羥基紅花黃色素A 對照品為中國食品藥品檢定研究院提供，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼和維生素C 購自美國Sigma 公司。 甲醇、乙醇、乙腈、磷酸均為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水。

試驗(yàn)采用的儀器有：超聲波清洗機(jī)（東莞康士潔超聲波科技有限公司）、Agilent1100 高效液相色譜儀（日立公司）、UV-2550 型UV-Vis 分光光度計(jì)(日本島津公司)、RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、AL-204型電子天平(上海儀器廠）和中藥粉碎機(jī)（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 羥基紅花黃色素A 的含量測定 羥基紅花黃色素A 對照品溶液配制： 稱取羥基紅花黃色素A 對照品6．5mg，溶解在25%甲醇溶液中，使其濃度為0．13mg·mL-1，即得SY 對照品溶液[6]。 供試樣品羥基紅花黃色素A溶液的提?。悍Q取供試15 個(gè)不同產(chǎn)地紅花藥材粉末各0．40g，加入50%乙醇10mL，密閉環(huán)境保存24h 后，50℃超聲提取30min，濾過，提取液過0．45μm 微孔濾膜濾備用。

色譜條件：Alltech Alltima-C18 色譜柱(4．6mm×250mm，5μm)； 流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0．7%磷酸溶液 （26∶2∶72），檢測波長403nm；流速為1mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10μL。

將供試品溶液和對照品溶液按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，根據(jù)式（1）計(jì)算15 個(gè)不同產(chǎn)地紅花羥基紅花黃色素A 含量。

式中：Cx為供試品濃度；CR為對照品濃度；Ax為供試品峰面積；AR為對照品峰面積。

1.2.2 指紋圖譜的建立 色譜條件:Alltech Alltima-C18色譜柱(4．6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0．5%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫程序見表1，運(yùn)行時(shí)間60min，流速為1mL·min-1， 檢測波長為265nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量10μL[7]。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.3 指紋圖譜的建立方法及相似度評價(jià) 將所得HPLC 圖譜依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A 版”軟件，對其峰數(shù)、峰面積和保留時(shí)間等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析。通過軟件中的“相似度計(jì)算”功能進(jìn)行供試品色譜圖譜與對照圖譜的相似度評價(jià)[8]。

1.2.4 紅花的抗氧化性

1.2.4.1 提取溶劑的篩選 稱取新疆塔城紅花藥材粉末3 份，各2g，分別以50%甲醇，50%乙醇和50%丙酮超聲振蕩提取20min，減壓濃縮至干，用無水乙醇溶解，定容于5mL 棕色瓶中，4℃保存，備用。

1.2.4.2 DPPH 自由基清除能力標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取2．5mg[DPPH·]加無水乙醇定容至100mL 容量瓶中，搖勻，備用。 將適量VC 溶解于無水乙醇中，配制成0．1，0．2，0．3，0．4，0．5mmoL·L-1VC 乙醇溶液。 將3．9mL[DPPH·]反應(yīng)液和0．1mL 的一系列VC 乙醇溶液混合，37℃下保存10min，采用紫外可見分光光度法于515nm 處測定吸光度，根據(jù)式（2）計(jì)算清除率K[9-10]。 以VC 的濃度為橫坐標(biāo)(X)，清除率為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0．601X+0．0411，R2=0．9975，在0．1～0．5mmoL·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.4.3 提取溶劑的確定 取[DPPH·]反應(yīng)液3．9mL，分別與3 種不同溶劑的新疆塔城紅花藥材提取物的不同體積（10～70μL)的供試品混合，無水乙醇補(bǔ)足至4mL 到EP 管中，37 ℃下保溫10min，采用紫外可見分光光度法于515 nm 波長處測定吸光度，按式（2）計(jì)算清除率，測定VC 含量。 根據(jù)加入樣品體積V（μL）與清除率K（%）的關(guān)系，以加入供試品的體積（10，20，30，40，50，60，70，80μL）為橫坐標(biāo)，清除率K（%）為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.2.4.4 抗氧化活性測定 取各產(chǎn)地紅花抗氧化成分提取物0．1mL 至EP 管中，加入[DPPH·]反應(yīng)液3．9mL，37℃下保存10min，采用紫外可見分光光度法于515nm 波長處測定吸光度，按式（2）計(jì)算清除率，測定維生素C含量（VCEAC)。

2 結(jié)果與分析

表2 不同產(chǎn)地紅花的含量Table 2 Content of safflower from different origins

2.1 不同產(chǎn)地紅花羥基紅花黃色素A 的含量

不同產(chǎn)地紅花藥材SY 的含量見表2， 甘肅蘭州和陜西寶雞紅花藥材不符合2020 版中國藥典規(guī)定。 四川簡陽和云南大理產(chǎn)的紅花SY 含量最高，超過3%。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

15 個(gè)不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜見圖1；15 個(gè)不同產(chǎn)地紅花之間相似度見表3。 經(jīng)相似度軟件分析，15 個(gè)產(chǎn)地紅花藥材除新疆塔城，甘肅蘭州，陜西寶雞相似度較低外，其他產(chǎn)地紅花藥材相似度在0．9～1．0 之間，說明與標(biāo)準(zhǔn)紅花藥材存在差異。

2.3 不同產(chǎn)地紅花藥材指紋圖譜的聚類分析

由圖2 可知，15 個(gè)不同產(chǎn)地紅花藥材最終可聚成2大類，其中甘肅蘭州紅花藥材和陜西寶雞紅花藥材為一類，從含量測定結(jié)果看甘肅蘭州和陜西寶雞紅花藥材羥基紅花黃色素A 不符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。 其他產(chǎn)地紅花藥材聚為一類，從含量測定結(jié)果看其他產(chǎn)地紅花藥材羥基紅花黃色素A 符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。 藥典方法鑒定結(jié)果同聚類分析鑒定結(jié)果相同。15 個(gè)不同產(chǎn)地紅花藥材可被分為2類，說明產(chǎn)地對紅花質(zhì)量的綜合評價(jià)影響不大，提示紅花的質(zhì)量除了與其產(chǎn)地有關(guān)外，還與紅花生長的環(huán)境、種植的時(shí)間、放置的溫度等因素有關(guān)[11-12]。

2.4 紅花的抗氧化性

2.4.1 提取溶劑的確定 由圖3 可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，紅花提取物的清除率均隨著提取物濃度的增加，呈現(xiàn)一定的正比例關(guān)系。紅花提取物、維生素C 對DPPH 自由基均有一定程度的抑制作用。用50%乙醇提取的新疆塔城紅花藥材的抗氧化能力相比于用50%甲醇和50%丙酮要高，所以采用50%乙醇進(jìn)行紅花藥材抗氧化成分的提取。

圖1 不同產(chǎn)地紅花的指紋圖譜Figure 1 Fingerprint of safflower from different origins

表3 不同產(chǎn)地紅花相似度Table 3 Similarities of safflower from different origins

2.4.2 抗氧化活性測定 由表4 可知，不同產(chǎn)地紅花抗氧化能力依次為新疆塔城紅花＞新疆伊寧紅花＞新疆吉木薩爾紅花＞新疆阿克蘇紅花＞新疆烏魯木齊紅花＞新疆伊犁紅花＞新疆哈密紅花＞浙江東陽紅花＞新疆昌吉紅花＞內(nèi)蒙古包頭紅花＞云南大理紅花＞四川簡陽紅花＞河南開封紅花＞陜西寶雞紅花。

圖2 不同產(chǎn)地紅花聚類結(jié)果樹狀圖Figure 2 Clustering results of safflower from different origins

圖3 不同濃度供試品提取物DPPH 清除能力Figure 3 Clearance capacity DPPH different concentrations of sample extracts

表4 不同產(chǎn)地紅花清除率Table 4 Removal rate of safflower from different origin

3 討論與結(jié)論

隨著社會(huì)的發(fā)展、人們生活水平的提高、自然環(huán)境的變化，心腦血管疾病發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，這時(shí)僅通過西藥來治療疾病有一定的局限性，這也使得人們更加關(guān)注中醫(yī)藥的治療作用，而中草藥憑借藥效穩(wěn)定、安全性高等優(yōu)點(diǎn)贏得中外學(xué)者的矚目[13-15]。 對于SY 的含量測定和指紋圖譜的建立，分別采用不同濃度甲醇、乙醇進(jìn)行超聲提取。結(jié)果表明：乙醇提取出的產(chǎn)物相比甲醇提取出的含量相差不大，但乙醇提取的產(chǎn)物相對應(yīng)的指紋圖譜的色譜峰更加清晰，不雜亂；對于乙醇濃度的選擇過高或過低均對SY 的含量產(chǎn)生影響，且與后續(xù)抗氧化實(shí)驗(yàn)的提取溶劑相同，更好的對不同產(chǎn)地紅花的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，故采用50%乙醇超聲提取。 本實(shí)驗(yàn)選擇指紋圖譜中峰面積最大的有效成分SY 進(jìn)行含量測定，研究結(jié)果表明不同來源的紅花藥材SY 的含量在0．48～32．5mg·g-1，具有較大波動(dòng)，表明不同產(chǎn)地的紅花藥材質(zhì)量存在較大的差異，對于不同產(chǎn)地紅花藥材的選用還需進(jìn)一步認(rèn)真考察[16]。 本研究建立了SY 指紋圖譜結(jié)合有效成分含量測定的質(zhì)量評價(jià)方法，從有效成分含量的角度上更全面、準(zhǔn)確、有效的控制紅花的質(zhì)量，保證其藥效，將為進(jìn)一步體外抗氧化性，體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、早期安全性評價(jià)等成藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[17]。

本研究考察了不同產(chǎn)地紅花藥材的抗氧化性， 通過采用50%甲醇，50%乙醇，50%丙酮對新疆塔城紅花藥材進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)50%乙醇提取的紅花抗氧化能力較好。 紅花藥材的抗氧化性的能力與SY 的含量大小有關(guān)，據(jù)報(bào)道，紅花中的黃酮類成分SY 和紅花黃色素B 均有抗氧化活性[18-19]。 云南紅花藥材SY 的含量高于新疆塔城紅花藥材，但其抗氧化活性不如新疆塔城紅花藥材，可能由于其中其他抗氧化成分高于新疆塔城紅花藥材，如黃酮類成分紅花黃色素B[20]。