同化和共代謝降解氯苯菌株的篩選與特性研究

郭江楓,邢志林,王永瓊,曹 昆,張學(xué)煉,茍 芳,石云椿,劉莉莎,趙天濤 (重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400054)

氯苯(CB)是重要的有機(jī)溶劑和化工生產(chǎn)中間體,廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、醫(yī)藥、農(nóng)藥、制革等工業(yè)生產(chǎn)[1-3],導(dǎo)致CB 污染遍布全球,甚至南極大陸和北極積雪中均有檢出[4-6],其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,揮發(fā)性強(qiáng),已成為水、土壤、沉積物和大氣環(huán)境中最普遍、最嚴(yán)重的氯代有機(jī)污染物之一[7-10].CB 已被美國環(huán)境保護(hù)署(USEPA)納為優(yōu)先控制污染物,其持久性和毒性作用對(duì)人類和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了嚴(yán)重威脅,如何有效實(shí)現(xiàn)環(huán)境中CB 的去除已成為氯代有機(jī)污染物降解領(lǐng)域研究的熱點(diǎn).

研究者提出了許多物化法去除環(huán)境中CB,包括吸附[11]、化學(xué)氧化[12]、光化學(xué)氧化[13]、電化學(xué)[14]、等離子體[15]等.這些方法往往需要大量能量,且價(jià)格昂貴,無法進(jìn)行廣泛應(yīng)用.與物化法相比,生物法具有耗能小、反應(yīng)條件溫和、處理成本低和二次污染小優(yōu)勢(shì),在CB 降解中具有重要的應(yīng)用潛力.CB 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,其生物降解性能依賴高效微生物菌株,國內(nèi)外針對(duì)功能菌株分離已開展多年研究,已分離的能夠降解CB 的純菌株包含了十幾個(gè)菌屬,模式菌株主要有紅球菌屬(Rhodococcus)[16],伯克菌屬(Pandoraea)[17],皮氏羅爾斯通菌屬(Ralstonia)[18],葡萄球菌屬(Planococcus)[19]和芽孢桿菌屬(Bacillus)[20].已分離菌屬主要來自于污染的土壤、泥漿和水體沉積物,CB 降解率約為70%～93.4%[21-23].CB 降解菌的分離純化盡管已開展多年,但由于菌株的耐受濃度低,環(huán)境適應(yīng)能力差,可用于環(huán)境中CB 修復(fù)的菌株還十分有限[24],已分離的功能菌株對(duì)CB 耐受性普遍低于150mg/L,CB 代謝速率為0.56～1.33mg/(L·h)[25-27],難以滿足大規(guī)模應(yīng)用的需要.挖掘高效CB 降解的生物資源一直是該領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn).

研究表明,厭氧條件下CB 可通過還原脫氯途徑發(fā)生轉(zhuǎn)化,但該過程CB 生物降解往往十分緩慢,且易形成致死及二次污染物[28];好氧條件下CB 可作為某些微生物的生長底物,為微生物提供碳源和能源發(fā)生轉(zhuǎn)化;此外,好氧條件下CB 也可被微生物通過共代謝途徑實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化.與厭氧降解相比,CB 的好氧生物轉(zhuǎn)化具有降解速率快,礦化徹底等優(yōu)勢(shì),更適合環(huán)境原位生物修復(fù)應(yīng)用[29],CB 好氧轉(zhuǎn)化是當(dāng)前關(guān)注重點(diǎn).污染場(chǎng)地環(huán)境中氧化還原電位、有機(jī)質(zhì)含量(生長底物)等的時(shí)空分布差異很大,而已分離的微生物對(duì)CB 降解往往只能通過一種途徑,這進(jìn)一步限制了單一功能菌株的應(yīng)用范圍[30].因此,篩選具有高耐受和廣泛適應(yīng)能力的CB 降解菌株,開展降解特性研究,對(duì)CB 污染場(chǎng)地的原位生物強(qiáng)化具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義.

基于此,本研究基于CB 污染土壤篩選功能菌株并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,考察CB 為底物條件下菌體的生長特性、CB 的耐受濃度和降解特性,及不同底物條件下CB 的共代謝降解特性,并分析了環(huán)境因子對(duì)菌株降解CB 的影響.研究結(jié)果將豐富CB 降解功能菌生物庫,并為CB 類有機(jī)污染物的原位修復(fù)提供重要支撐.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

污染土壤采自重慶市大渡口區(qū)原重慶鋼鐵股份公司動(dòng)力廠五萬立方煤氣柜周邊污染土壤(106°29′20″E,29°28′30″N),該場(chǎng)地是上世紀(jì)40 年代配套型鋼廠生產(chǎn)而建設(shè),在2010 年隨著重鋼的搬遷逐步停產(chǎn),該土壤污染物主要包括鉛、鎘等重金屬,C3～C35 類石油烴及CB、五氯苯(PeCB)等氯代芳烴.污染土壤取4mm 篩下和2mm 篩上顆粒.

1.2 培養(yǎng)基配制

無機(jī)鹽培養(yǎng)基:CaCl20.1g,MgSO4·7H2O 0.4g,NH4Cl 2.02g,KH2PO43.0g, Na2HPO4·12H2O 17.7g,NaCl 0.5g,蒸餾水1L,pH 值:6.5～7.0.

LB 培養(yǎng)基:酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,蒸餾水1L.

選擇性培養(yǎng)基A:酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,蒸餾水1L,一定濃度的CB(阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司,分析純),pH 值:6.5～7.0(固體培養(yǎng)基+1.5%～2.0%的瓊脂).

選擇性培養(yǎng)基B:CaCl20.1g,MgSO4·7H2O 0.4g,NH4Cl 2.023g,KH2PO43.0g,Na2HPO4·12H2O 17.7g,NaCl 0.5g,蒸餾水1L,一定濃度CB(固體培養(yǎng)基+1.5%～2.0%的瓊脂).培養(yǎng)基所需藥品來自于成都市科龍化工試劑廠,分析純.

1.3 菌株的分離與鑒定

取污染土壤10g,置于裝有100mL 去離子水的250mL 的錐形瓶中,在30℃、160r/min 的搖床中充分振蕩3h.靜置20min 后取上清液10mL 接種于裝有100mL LB 培養(yǎng)基的250mL 錐形瓶中,同樣條件培養(yǎng)72h.保存作為種子液.

取富集后種子液5mL 加入到裝有50mL 選擇培養(yǎng)基B 的125mL 血清瓶中,分別加入60,130,200mg/L 的CB,置于30℃、160r/min 搖床中培養(yǎng).3d 后,取5mL 菌液接種選擇培養(yǎng)基A 中,相同條件培養(yǎng).以相同方式連續(xù)4 次傳代培養(yǎng),過程中連續(xù)監(jiān)測(cè)OD600和CB 濃度變化.

將所獲得混合菌進(jìn)行梯度稀釋,將稀釋梯度為10-3、10-4和10-5的菌液涂布在選擇性固體培養(yǎng)基B 中,CB 濃度為200mg/L,置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察到肉眼可見的菌落長出,挑取生長較快、個(gè)體較大的單菌落進(jìn)行多次平板劃線,直到得到單一菌株.將純化菌株接種到以CB 為唯一碳源的液體培養(yǎng)基B 中傳代培養(yǎng).以上均要在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行.

將純化后的菌株在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng),待長出單個(gè)菌落后進(jìn)行形態(tài)觀察并進(jìn)行革蘭氏染色.取上 述細(xì)菌培養(yǎng)液 1～5mL 用 Mobio PowerSoil? DNA Isolation Kit 試劑盒提取樣品中微生物總基因組 DNA,并利用通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.25 μL 擴(kuò)增體系為:DNA 模板1 μL,1.1×T3Super PCR Mix22mL,27F (10μmol/L)和1492R (10μmol/L)各1 μL.PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?98℃3min;98℃ 10s,58℃ 10s,72℃ 10s,30 個(gè)循環(huán);72℃2min.獲得的PCR 產(chǎn)物取5μL 進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳,使用切膠回收目的片段進(jìn)行DNA 測(cè)序,DNA 的測(cè)序委托四川擎科生物公司完成.降解菌16S rRNA基因序列通過BLAST 程序與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析.利用MEGA 7.0 軟件[31]進(jìn)行聚類分析,設(shè)置Bootstrap 值為1000,采用Neighbor-joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.

1.4 菌株生長曲線的測(cè)定

1.5 菌株對(duì)CB 的降解實(shí)驗(yàn)

1.5.1 同化降解實(shí)驗(yàn) 無菌條件下,功能菌株接種到含選擇性培養(yǎng)基A 中,在30℃、160r/min 條件下培養(yǎng)5d,4000r/min 離心10min,去除上清液,用無機(jī)鹽培養(yǎng)基(已滅菌)重懸,重復(fù)上述步驟2次,最終OD600=0.7.以此菌懸液為初始接種物.以CB 為唯一底物,設(shè)置培養(yǎng)基中CB 濃度為60～200mg/L,取2.5mL 上述菌懸液接種培養(yǎng)基中,30℃、160r/min 振蕩培養(yǎng),設(shè)置接種滅活菌液為對(duì)照組,所有組別一式3 份,每隔24h 取樣,檢測(cè)菌體生長和CB 濃度變化情況.

1.5.2 共代謝降解實(shí)驗(yàn) 以檸檬酸鈉和琥珀酸鈉為生長底物,濃度為4g/L,CB 為共代謝底物,CB 濃度為20～160mg/L.不同體系中接種對(duì)數(shù)期的菌懸液,使初始OD600達(dá)0.1 左右,聚四氟乙烯呂塞密封后于160r/min、30℃的搖床中培養(yǎng),檢測(cè)CB 濃度和菌體濃度變化情況.

1.5.3 環(huán)境因子影響試驗(yàn) 設(shè)置單因素實(shí)驗(yàn),分別考察共代謝條件下溫度(20,25,30,35,40℃),pH 值(4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)和接種量(1%,2.5%,5%,7.5%,10%)對(duì)菌體生長及CB 降解的影響.在50mL 已滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入CB 以及0.2g 的檸檬酸鈉作為碳源,并接種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的菌懸液,使初始OD600達(dá)到0.1 左右,具塞密封后置于不同條件下培養(yǎng),檢測(cè)單一變量條件下菌體濃度和CB 濃度變化情況.

式中:η為CB 降解率;c0和ct分別表示CB 的初始濃度和t 時(shí)刻CB 濃度,mg/L;V0和Vt分別表示溶液初始體積和t 時(shí)刻液體體積mL.

式中:VCB為CB 降解速率mol/(gcell·h);t 為時(shí)間,h;mcell為菌體濃度,mg/L;

式中:Scell表示細(xì)胞平均增長速率gcell/(molCB·h);ct'、c0'表示t 時(shí)間和初始時(shí)細(xì)胞的濃度,mg/L;Vt'、V0'分別表示t 時(shí)刻和初始時(shí)刻培養(yǎng)基體積,mL;

式中:c1,CB,0、c1,CB,t分別表示CB 初始濃度和第t 時(shí)刻CB 濃度,mg/L;k1,CB為CB 的降解速率常數(shù).

1.6 分析檢測(cè)

CB 濃度的測(cè)定:采用氣相色譜(重慶川儀分析儀器有限公司,SC-8000)定量分析氣相中CB 濃度,色譜柱為不銹鋼色譜柱GDX04 2m;氣相色譜條件:進(jìn)樣器溫度、柱溫和ECD 檢測(cè)器溫度分別為80,120和200 ℃;氮?dú)鉃檩d氣,載氣流速為40mL/min;尾吹氣速為 10mL/min;進(jìn)樣量為 0.5mL;基流補(bǔ)償為0.00nA.

菌體濃度的測(cè)定:采用752 型紫外/可見分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司),在600nm波長下測(cè)定菌體的吸光度(OD600).

數(shù)據(jù)用Excel 2016 軟件統(tǒng)計(jì)和分析,origin 9.0做圖.最大比生長速率(μmax,h-1)通過內(nèi)插法計(jì)算.

2 結(jié)果與討論

2.1 CB 降解菌的分離與鑒定

以CB 為唯一底物對(duì)菌液進(jìn)行平板劃線,經(jīng)多次分離純化,獲得能以CB 為碳源和能源生長的菌株.該菌株在選擇性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d 后,菌落呈圓形,乳白色或粉紅色,菌落直徑0.5～0.8mm,長0.9～2.0mm(圖1(a));電鏡掃描顯示該菌株為短桿狀,菌體長為1.0～1.5μm,直徑為0.6～0.8μm,經(jīng)革蘭氏染色顯示為陰性(G-).將菌株的16sRNA 基因序列通過NCBI BLAST 與GenBank 對(duì)比,構(gòu)建基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖1(c)所示.比較發(fā)現(xiàn)該菌株與粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia sp. strain RJ-10-16、Serratia sp. strain RJ-10-14、Serratia marcescens strain AG2105、Serratia sp. strain KUJM3、Serratia marcescens strain DAP32 等菌株的同源性為99%,該菌株與CB 降解菌Escherichia sp. strain hermanii 同源 性 較 近, 與 Ralstonia pickettii strain L2 、Pseudomonas sp. JS6 和Labrys portucalensis strain F11 同源性相距很遠(yuǎn),將其命名為Serratia marcescans TF-1(保藏號(hào):M 2019674,專利號(hào):201911162719.4).現(xiàn)有已報(bào)道的同類菌株可用于降解五氯酚[32]、氰化物[33]、甲硫磷[34]和柴油[35]等的物質(zhì),本文中分離的菌株是首次發(fā)現(xiàn)的具有CB 降解功能的沙雷氏菌.對(duì)TF-1 進(jìn)行生長曲線的測(cè)定,通過Boltzmann 方程模擬確定了TF-1 菌株的生長模型(圖1(d)).該菌在0～20h 生長較慢,20h 之后迅速進(jìn)入生長期,說明該菌能夠較快的適應(yīng)生長環(huán)境,70h 進(jìn)入穩(wěn)定期.在菌株培養(yǎng)50h 后,菌株的OD600達(dá)到約1.0,擬合得到最大比生長速率(μmax)為0.04h-1(R2=0.987).

圖1 TF-1 的菌落形態(tài)及生長曲線Fig.1 Colony morphology of strain TF-1 and construction of phylogenetic tree

分別以CB、葡萄糖、乳糖、乙酸鈉、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、乙醇和苯酚為唯一碳源考察了TF-1 的底物范圍,結(jié)果如表1所示.以葡萄糖為底物時(shí),TF-1生長情況最佳,OD600值最大為0.52±0.031;其次以琥珀酸鈉和檸檬酸鈉底物時(shí),TF-1 最大OD600值為0.37～0.49.以CB 和乳糖為底物時(shí),TF-1 生長減緩,OD600的最大值為0.23～0.3,表明功能菌TF-1 對(duì)其利用難度較大.以苯酚和乙醇為唯一碳源時(shí),功能菌TF-1 無增長,可能是因?yàn)楸椒拥奶厥饨Y(jié)構(gòu)以及乙醇的滅菌功能使得TF-1 對(duì)其難以有效的代謝,導(dǎo)致TF-1 無生長[36].

表1 Serratia marcescans TF-1 對(duì)不同碳源的利用情況Table 1 Growth of Serratia TF-1on Different Carbon Sources

2.2 TF-1 同化降解CB

圖2 以CB 為底物TF-1 的生長及CB 濃度變化曲線Fig.2 CB as substrate TF-1growth and CB concentration change

與其他生物降解方式相比,同化降解可直接將污染物轉(zhuǎn)化為無機(jī)物,優(yōu)勢(shì)顯著.考察以CB 為唯一底物TF-1 的生長情況及對(duì)其降解特性.不同CB 濃度下TF-1 的生長如圖2(a)所示.實(shí)驗(yàn)條件下,TF-1 在所有濃度上均能生長,前4d 生長緩慢,OD600增加緩慢,第5d 進(jìn)入對(duì)數(shù)期,最大比生長速率為0.015～ 0.42h-1,細(xì)胞平均增長速率為0.0063～0.022gcell/ (molCB·h). CB 剩余率隨時(shí)間變化如圖2(b)所示,空白組中CB 剩余率幾乎無變化,實(shí)驗(yàn)組中CB 剩余率隨時(shí)間逐漸減小,表明CB 被菌株消耗,相同時(shí)間內(nèi),CB 濃度越大,剩余率越大.CB 的降解特性參數(shù)如表2 所示.隨著CB 濃度增大,CB 降解速率(VCB)逐漸減小,變化范圍為1.35～4.47mol/(gcell·h),是當(dāng)前已報(bào)道CB 降解速率的2 倍[21].隨cCB增大,CB 降解能力下降, TF-1 對(duì)低濃度CB 利用率更高,表明CB對(duì)TF-1具有毒性作用;而最高菌體濃度無顯著性差異,在cCB為200mg/L 的降解率仍有41.6%,表明該菌株具有高的CB 耐受性.

表2 CB 同化降解特征參數(shù)Table 2 Characteristic parameters of CB assimilation degradation

2.3 共代謝條件下CB 的生物轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以葡萄糖和乳糖為底物時(shí),無CB 降解,本文以琥珀酸鈉和檸檬酸鈉為底物考察了CB 的共代謝降解特性,結(jié)果如圖3所示,與僅以CB為唯一碳源相比,琥珀酸鈉和檸檬酸鈉作為底物促進(jìn)TF-1 生長.以琥珀酸鈉為底物,cCB＜60mg/L 時(shí),對(duì)TF-1 生長的影響微弱;cCB＞80mg/L 時(shí),TF-1 生長顯著抑制;以檸檬酸鈉為底物,cCB＜100mg/L 時(shí),對(duì)TF-1 生長影響較小;cCB＞120mg/L 時(shí),TF 生長受到抑制,表明檸檬酸鈉為底物TF-1 的耐受性更高.最大比生長速率μmax隨cCB的變化如圖3(e)所示,cCB＜80mg/L 時(shí),μmax(檸檬酸鈉)(0.21～0.87h-1)＞μmax(琥珀酸鈉)(0.20～0.81h-1), cCB＞80mg/L時(shí),μmax(檸檬酸鈉)(0.086～0.21h-1)＜μmax(琥珀酸鈉)(0.17～0.25h-1),說明在低CB 濃度下,檸檬酸鈉為底物促進(jìn)作用較強(qiáng),在高CB 濃度下,以琥珀酸鈉為底物更有優(yōu)勢(shì),總體上μmax隨著CB 濃度的升高而降低,說明功能菌TF-1 受到CB 的毒性作用增強(qiáng).

共代謝條件下,CB 剩余率隨時(shí)間變化如圖3(b)、3(d)所示,其降解趨勢(shì)基本相同,在cCB＜20mg/L時(shí),CB 的抑制毒性較小,5d CB 去除率為98%,隨著cCB升高,CB 剩余率也逐漸升高, cCB為40～60mg/L時(shí),CB 剩余率為20%左右,當(dāng)cCB＞80mg/L 時(shí),CB 的降解影響較小,5d后CB剩余率基本維持在40%左右,分析原因可能是檸檬酸鈉和琥珀酸鈉均為小分子有機(jī)碳源,誘導(dǎo)TF-1 產(chǎn)生相關(guān)酶的能力相近[37].

TF-1 對(duì)CB 的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng).動(dòng)力學(xué)常數(shù)k 隨cCB的變化如圖3(f)所示.一階動(dòng)力學(xué)常數(shù)基本維持在6.8～13.9h-1之間.CB 降解率隨cCB的變化如圖3(g)所示.不同底物條件下,隨cCB增大,CB降解率變化趨勢(shì)相同,均隨濃度增大而降低;cCB相同時(shí),檸檬酸鈉為底物的降解率略高(不超過5%).VCB隨cCB的變化如圖3(h)所示.cCB＜80mg/L 時(shí),VCB(檸檬酸鈉)(0.15～0.47mol/(gcell?h))＜VCB(琥珀酸鈉)(0.17～0.48mol/(gcell?h)),cCB＞80mg/L 時(shí),VCB(檸檬酸鈉)(0.61～1.11mol/(gcell?h))＞VCB(琥珀酸鈉)(0.56～0.95mol/(gcell?h)),表明在低濃度CB 污染時(shí),琥珀酸鈉為底物更利于CB 的降解,高濃度CB 污染時(shí),檸檬酸鈉為底物則更佳.共代謝降解速率受生長底物和共代謝底物濃度比的影響,該研究表明最適生長底物/共代謝底物濃度比受底物種類的影響.

圖3 TF-1 對(duì)CB 的共代謝降解特性Fig.3 Co-metabolic degradation properties of TF-1on CB

2.4 CB 生物降解的影響因素

溫度、pH 值和接種量是微生物生長和有機(jī)物降解的重要影響因素,考察了3 個(gè)因子對(duì)TF-1 生長及CB降解的影響.溫度對(duì)TF-1的生長及CB降解的影響如圖4所示.由圖4(a)可知,15℃條件下,4d內(nèi)微生物幾乎無生長,在20～35℃內(nèi),微生物均能生長,30℃ TF-1 生長速率最快,48h 達(dá)到穩(wěn)定期.一定范圍內(nèi)溫度升高,可促進(jìn)微生物活性,但溫度過高也會(huì)使酶活降低甚至失活,當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí),TF-1幾乎無生長.綜上,TF-1在20～35℃溫度范圍內(nèi)生長良好,最適生長溫度為30℃ .

圖4 溫度對(duì)TF-1 的生長及CB 降解的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of TF-1and the degradation of CB

與生長情況類似,15℃時(shí),由于TF-1 無生長,4d內(nèi)cCB無顯著變化;20～35℃范圍內(nèi), cCB均有所下降,30℃時(shí)濃度下降最快(圖4b),30℃時(shí)降解率和VCB最大,分別為93.7%和0.47mg/(L·h) (圖4c),表明TF-1對(duì)CB 的最適共代謝降解溫度為30℃ .不同溫度條件下VCB隨時(shí)間的變化如圖4(d)所示,均在第2～3d VCB達(dá)到最大值,為0.11～0.92mg/(L·h),此時(shí)微生物濃度最大.

pH 值對(duì)TF-1 的生長及CB 的降解影響如圖5所示.設(shè)置pH 值范圍為4～10,pH 值在5～8 范圍內(nèi),TF-1 生長無顯著影響;pH 值為9 時(shí),延遲期顯著增大,7d 后,耐受性提高后,菌體濃度微量增大;當(dāng)酸堿性持續(xù)增強(qiáng),pH 值為4 或8 時(shí),11d 內(nèi),菌體無生長(圖5a).在各pH 值條件下, cCB均呈下降趨勢(shì),pH 值為7 時(shí),cCB下降最快,表明該條件下菌體酶活性最強(qiáng);pH 值為5、6、8 和9 時(shí),cCB變化趨勢(shì)基本一致;pH值為10 時(shí)CB 的殘余量最高,為34.81mg/L,降解率最低為38%;pH 值為4 時(shí),降解率為47%,表明在酸性條件或是堿性環(huán)境中均對(duì)CB 有降解能力(圖5b).圖5(c)為CB 降解率隨pH 值的變化曲線,在pH 值為7時(shí)降解活性最強(qiáng);進(jìn)一步證實(shí)該菌屬可適應(yīng)多種酸堿環(huán)境,在中性環(huán)境中活性最強(qiáng).圖5(d)表示TF-1 每天的降解速率,從圖中可以看出,在第2d 和第6d 均出現(xiàn)峰值,可能是因?yàn)槌跏糡F-1 需要利用CB 進(jìn)行繁殖生長,隨著時(shí)間增長,TF-1 在脅迫條件下可能分泌的一些物質(zhì)緩和了培養(yǎng)基中的酸堿度,在第6d 培養(yǎng)基中pH 值維持中性范圍,TF-1 的活性得以恢復(fù),所以導(dǎo)致第2d 和第6d 對(duì)CB 降解率均達(dá)到最大.

本實(shí)驗(yàn)選取的生物接種量為1%～10%,接種量對(duì)菌株TF-1 的生長及CB 降解的影響如圖6 所示.隨著接種量的增加,微生物的生長及CB 降解趨勢(shì)基本一致(圖6a、6b 所示),如圖6(b)所示,接種量為1%、2.5%、5%、7.5%、10%時(shí),CB 最終降解率無顯著差異,降解菌生物量的升高短期內(nèi)會(huì)促進(jìn)CB的生物降解,但不影響最后的降解以及微生物的生長.圖6(c)為不同接種量下CB 總降解率及總降解速率,降解速率接種量為5%時(shí)降解率和VCB達(dá)到最大值,分別為72%和0.19mg/(L·h).不同接種量條件下,VCB隨時(shí)間的變化曲線如圖6(d)所示.第6d VCB值最大,可能是因?yàn)樵诘?d相關(guān)酶量積累到了最大值從而提升了 VCB.綜上所述,接種量為5%時(shí)是TF-1 的最適接種量.

圖5 pH 值對(duì)TF-1 生長及CB 降解的影響Fig.5 Effect of pH on TF-1growth and CB degradation

圖6 接種量對(duì)TF-1 生長及CB 降解的影響Fig.6 Effect of inoculum on TF-1 growth and CB degradation

對(duì)CB 降解微生物進(jìn)行了廣泛調(diào)研,如表3 所示,與現(xiàn)有已知菌株相比,TF-1 的生長溫度范圍更廣耐酸堿能力更強(qiáng).TF-1 的 CB 耐受濃度超過200mg/L,遠(yuǎn)高于現(xiàn)有報(bào)道微生物的耐受濃度[21].污染場(chǎng)地環(huán)境復(fù)雜,作為持續(xù)性有機(jī)污染物,CB 降解困難,貧營養(yǎng)和富營養(yǎng)場(chǎng)地中均有污染,異養(yǎng)同化菌株在貧營養(yǎng)場(chǎng)地中適用性更強(qiáng);研究表明,共代謝降解速率比同化速率更快,富營養(yǎng)場(chǎng)地中共代謝菌株適用性更強(qiáng).當(dāng)前功能菌株主要通過單一途徑對(duì) CB 進(jìn)行降解,限制菌體的廣泛使用,TF-1 不僅能夠異養(yǎng)同化氯苯,還可以琥珀酸鈉、檸檬酸鈉等為底物共代謝降解CB,TF-1 適用范圍更廣,可為貧營養(yǎng)和富營養(yǎng)污染場(chǎng)地CB 的修復(fù)提供重要的生物資源.

表3 CB 降解的細(xì)菌比較Table 3 Comparison of CB degrading bacteria

3 結(jié)論

3.1 粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens TF-1 可利用葡萄糖、乳糖、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、CB 等多種有機(jī)物為底物進(jìn)行生長.CB 為底物時(shí)TF-1 的μmax為0.022gcell/(molCB·h),VCB為1.35mol/(gcell·h),對(duì)CB 耐受性高于200mg/L;隨cCB增大,VCB和μmax逐漸減小.

3.2 以琥珀酸鈉和檸檬酸鈉為底物,TF-1可共代謝降解CB.VCB最高分別為0.95 和1.11mol/(gcell?h),cCB＜80mg/L時(shí),檸檬酸鈉更能促進(jìn)微生物生長;當(dāng)cCB＞80mg/L,VCB(檸檬酸鈉)(0.61～1.11mol/(gcell?h))＞VCB(琥珀酸鈉)(0.56～0.95mg/(L·h)),此時(shí)以檸檬酸鈉為底物更利于CB 降解.

3.3 TF-1 在20～35℃范圍內(nèi)生長良好,30℃為最適生長溫度,平均VCB為0.472mg/(L·h);TF-1pH值為5～9 時(shí)生長良好,最適pH 值為7,平均VCB為0.237mg/(L·h);接種量為5%時(shí),CB 降解能力最強(qiáng).TF-1 具有相對(duì)較高的CB 耐受性和耐酸堿特性,可同時(shí)進(jìn)行同化和共代謝降解CB.