土壤微生物電化學(xué)系統(tǒng)降解四環(huán)素的機(jī)理

趙曉東,李曉晶,趙鵬宇,宋敏麗,燕平梅,任天志,李永濤,3 (.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 3009；.太原師范學(xué)院生物系,山西 榆次03069；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,廣東 廣州 5064)

近年來(lái),抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的濫用[1-2],以及其在動(dòng)物體內(nèi)的難以吸收性(排泄率達(dá)40%～90%)[3],導(dǎo)致抗生素在動(dòng)物糞便中具有極高的檢出率和殘留量[4].畜禽糞肥農(nóng)用造成了農(nóng)業(yè)土壤中嚴(yán)重的抗生素污染,尤其是四環(huán)素在土壤中的含量高達(dá)0.16～10967ng/g[5].近期研究發(fā)現(xiàn),土壤中的四環(huán)素及其抗性基因(ARGs)會(huì)通過(guò)食物鏈傳播,從而對(duì)人類(lèi)健康造成威脅[6-8].

微生物修復(fù)作為一種綠色、環(huán)境友好型的修復(fù)技術(shù)在土壤污染治理過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[9].隨著有機(jī)污染物的氧化降解,污染土壤中氧化劑(電子受體)逐漸消耗以致缺乏限制了微生物的修復(fù)效率,而土壤微生物電化學(xué)系統(tǒng)(SMES)能夠提供固體陽(yáng)極作為永不枯竭的電子受體,在將土壤中有機(jī)污染物降解的同時(shí)還能將此過(guò)程中的化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化為生物電能,既解決了微生物修復(fù)效率提升的技術(shù)瓶頸,又實(shí)現(xiàn)了污染治理與固廢資源化利用的雙功效,且該過(guò)程無(wú)二次污染[10-12].

最新的研究表明,運(yùn)用微生物電化學(xué)系統(tǒng)(MES)可以高效地去除水體中殘留的四環(huán)素類(lèi)抗生素,雖然MES 對(duì)ARGs 的抑制效能仍存在一定爭(zhēng)議,但四環(huán)素類(lèi)抗生素的去除率在7d 內(nèi)較對(duì)照處理可提高70%～125%[13-17].為了進(jìn)一步明確MES 在四環(huán)素污染修復(fù)中的應(yīng)用前景,本文前期研究首次將MES 應(yīng)用至四環(huán)素污染土壤中,研究發(fā)現(xiàn)相比于黑土、紅壤和黃棕壤,SMES 更適用于潮土,四環(huán)素降解率較對(duì)照可提高39%[18],且ARGs 豐度較對(duì)照下降了28%～47%[19].土壤酶是土壤重要的組成成分,主要來(lái)源于微生物和植物根系的分泌,它不僅能夠有效驅(qū)動(dòng)土壤的養(yǎng)分循環(huán),而且還是土壤有機(jī)污染生物修復(fù)過(guò)程中的重要物質(zhì)[20].但SMES 是如何調(diào)控微生物分泌功能酶從而促進(jìn)四環(huán)素的降解效能仍有待深入研究.因此,本文旨在探明SMES 運(yùn)行過(guò)程中四環(huán)素降解-酶活性-微生物之間的內(nèi)在聯(lián)系,以期揭示該技術(shù)對(duì)四環(huán)素的生物降解機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本研究的供試土壤為潮土,采自天津武清區(qū)(N39°27′20.59″, E117°09′26.18″).將采集的土壤在陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干,研磨并過(guò)2mm 篩保存?zhèn)溆?其基本土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1.

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 The physicochemical properties of experimental soils

1.2 反應(yīng)器構(gòu)型與操作

本研究選取了活性炭空氣陰極和碳纖維布陽(yáng)極的單室反應(yīng)器構(gòu)型(體積為6cm×6cm×9cm),如圖1(a),活性炭空氣陰極的制作方法參照課題組先前的報(bào)道[21].為了降低土壤內(nèi)阻,增強(qiáng)SMES 的電子傳遞效率,向土壤中摻入質(zhì)量比為1%(以干土計(jì))的碳纖維絲(長(zhǎng)1cm)[22].碳纖維布與碳纖維絲在使用之前均用丙酮浸泡過(guò)夜后用蒸餾水沖洗3～5 次備用.反應(yīng)器填裝的土量為300g,將120mL 的蒸餾水加入土壤與碳纖維絲一起攪拌均勻置入反應(yīng)器中,并在反應(yīng)器土壤表層加約1cm 厚的蒸餾水作為水封層以阻隔氧氣的入侵.

圖1 土壤微生物電化學(xué)系統(tǒng)構(gòu)型和采樣方案示意Fig.1 The construction of soil microbial electrochemical system and the sampling scheme of the experiment

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 The experimental design

本試驗(yàn)共設(shè)兩組:第一組為四環(huán)素染毒組(染毒濃度為5mg/kg),第二組為不添加四環(huán)素對(duì)照組.每組包含2 個(gè)閉路處理,一個(gè)開(kāi)路對(duì)照和一個(gè)無(wú)電極對(duì)照.所有處理均置于恒溫培養(yǎng)箱在30℃的條件下暗室培養(yǎng),試驗(yàn)周期為58d.試驗(yàn)結(jié)束后拆反應(yīng)器取樣,取樣部位(圖1b)分別設(shè)定在陰極表面向上1cm以內(nèi)的區(qū)域(C 層)、陽(yáng)極表面上下各0.5cm 的區(qū)域(A層)和從土壤表層向下1cm以內(nèi)的區(qū)域(S層).實(shí)驗(yàn)方案具體如下(表2):

1.3 測(cè)試方法

土壤pH 值和電導(dǎo)率的測(cè)定方法參照課題組先前報(bào)道的文獻(xiàn)[23]:稱(chēng)取2g 冷凍干燥后的供試土壤倒入50mL 離心管中,按照土水比1:5 加入10mL 去離子水,在渦旋儀上以2500r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩30min使土水充分混勻,用超高速離心機(jī)以10000r/min 的轉(zhuǎn)速離心7min,收集上清液后用pH計(jì)和電導(dǎo)率儀測(cè)定土壤的pH 值和電導(dǎo)率.

采用土壤酶試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測(cè)定土壤脫氫酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶和漆酶的活性,前處理方法根據(jù)試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.分別在485nm、430nm、240nm 和420nm 波長(zhǎng)處使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定土壤脫氫酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶和漆酶活性[23-25].

此外,土壤中四環(huán)素殘留量和微生物群落(包括細(xì)菌、真菌和古菌)的測(cè)定方法參見(jiàn)本文前期研究成果[19].

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

Network 圖用于分析四環(huán)素降解、脫氫酶活性和三域微生物之間的關(guān)系,所用軟件為Cytoscape 3.7.0.為了增強(qiáng)Network 圖的可讀性,首先借助IBM SPSS Statistics 2.2 軟件對(duì)四環(huán)素降解、脫氫酶活性和三域微生物之間做Spearman 相關(guān)性分析,篩選出達(dá)顯著正相關(guān)(P＜0.05)的兩兩關(guān)系進(jìn)行作圖.Network 圖中的節(jié)點(diǎn)代表四環(huán)素降解、脫氫酶活性或者微生物,連接節(jié)點(diǎn)的邊代表兩節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系[26].采用Canoco5.0 軟件進(jìn)行冗余分析,采用Office 2007、Origin 2019 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖,采用IBM SPSS Statistics 2.2 軟件進(jìn)行組間差異分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 四環(huán)素在不同處理中的降解率

四環(huán)素在TC 處理展現(xiàn)出最高降解率(70%),在TO 處理中次之(66%),它們較在TN 處理中的降解率分別提高35%和27%(P＜0.05,圖2),表明SMES 可有效提升土壤中四環(huán)素的去除效率[19].從不同土層角度來(lái)看,四環(huán)素在閉路和開(kāi)路A 層的降解率最高,其次為C 層,均比閉路和開(kāi)路處理相應(yīng)的S 層高出約8% (P＜0.05).

四環(huán)素在環(huán)境中的降解途徑主要包括非生物降解和生物降解,其中非生物降解主要包括光解、氧化降解和水解等[27].在本研究中,整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程均在避光條件下進(jìn)行,且未添加任何氧化劑.同時(shí),所有處理均處于淹水條件,理論上各處理對(duì)四環(huán)素的水解能力一致.因此,非生物降解并不是SMES 促進(jìn)四環(huán)素降解的主要途徑.相比之下,該系統(tǒng)能提供生物電流刺激微生物的代謝活性,從而強(qiáng)化對(duì)污染物的生物降解效率[28-29].因此,認(rèn)為本研究中生物降解是SMES 提升四環(huán)素降解效率的主要方式.

圖2 四環(huán)素在不同處理中的降解規(guī)律Fig.2 Degradation rate of tetracycline in different treatments

2.2 不同處理中土壤pH 值和電導(dǎo)率的變化

經(jīng)過(guò)58d 的實(shí)驗(yàn)周期,土壤pH 值展現(xiàn)出規(guī)律性的變化(圖3a).與原始土壤OS(7.72±0.02)相比,閉路處理的pH 值呈現(xiàn)出一定的降低趨勢(shì),而無(wú)電極處理則呈現(xiàn)升高趨勢(shì).例如TC 處理較OS 處理pH 值降低了0.14 個(gè)單位(P＜0.05),而CN 處理較OS 增加了0.17 個(gè)單位(P＜0.05).土壤pH 值在不同處理的變化趨勢(shì)與氧化還原電位有關(guān),通常情況下土壤氧化還原電位每下降59mV,pH 值會(huì)相應(yīng)增加一個(gè)單位,這是因?yàn)橥寥缽难趸瘧B(tài)向還原態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)會(huì)消耗土壤中的氫離子,氫離子的消耗直接引起了土壤pH 值的增加[30].而據(jù)前人研究表明,SMES 的氧化還原電位顯著高于無(wú)電極對(duì)照[31].同時(shí),SMES 不同層之間比較發(fā)現(xiàn),土壤pH 值在陰極(C 層)明顯高于陽(yáng)極(A層)(圖3c),這與前人的研究一致,這是因?yàn)殛帢O表面反應(yīng)消耗H+引起OH-的積累而導(dǎo)致pH 值在陰極升高,而同時(shí)陽(yáng)極附近會(huì)產(chǎn)生H+降低pH 值[11-32].

與不添加四環(huán)素的處理相比,添加四環(huán)素處理的土壤電導(dǎo)率有明顯增加,且電導(dǎo)率在閉路系統(tǒng)中進(jìn)一步被提高(圖3b).在閉路系統(tǒng)中,與相應(yīng)的陽(yáng)極附近(A 層)相比,陰極附近(C 層)和表層(S 層)的電導(dǎo)率在TC 處理中增加了38%～45%,在CC 處理中增加了30%～47%(圖3d).開(kāi)路處理與閉路處理展現(xiàn)出相同的趨勢(shì).而在無(wú)電極處理中,土壤電導(dǎo)率從S 層至C 層逐漸降低.例如,在TN 處理中,S 層的電導(dǎo)率較A層和C 層分別高出42%和73%.分析原因,第一,鹽離子隨著水分的蒸發(fā)而逐漸擴(kuò)散至土壤表層(S 層),因此所有處理S 層的電導(dǎo)率均高于A 層;第二,閉路和開(kāi)路處理陰極附近土壤電導(dǎo)率高于陽(yáng)極的原因可能是水分會(huì)通過(guò)陰極蒸發(fā)或者生物電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)從而帶動(dòng)鹽離子的遷移[33].

圖3 不同處理土壤pH 值和電導(dǎo)率的變化Fig.3 Change of soil pH value and conductivity in different treatments

2.3 不同處理中土壤酶活性的變化

與OS 處理相比,土壤脫氫酶活性在CN 處理中下降了53%(P＜0.05),添加四環(huán)素(TN 處理)進(jìn)一步降低了脫氫酶的活性,降幅達(dá)38%(圖4a).而與TN處理相比,電極引入(TO 處理)后脫氫酶活性增加了126%(P＜0.05),且脫氫酶活性在閉路處理(TC 處理)中被進(jìn)一步提高.脫氫酶可以在一定程度上反應(yīng)土壤中微生物的降解活性狀況,說(shuō)明在生物電流的不斷刺激下,微生物的新陳代謝得到了強(qiáng)化,進(jìn)而有利于對(duì)四環(huán)素的降解[34].由圖5a 可知,脫氫酶活性在TC 和TO 處理的陽(yáng)極區(qū)域最高,這與四環(huán)素降解率的趨勢(shì)一致(圖2).

與土壤脫氫酶活性趨勢(shì)相似,各處理的土壤多酚氧化酶活性也在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后呈現(xiàn)出不同程度的降低,降幅達(dá)16%～34%(P＜0.05,圖4b).與不加四環(huán)素處理相比,多酚氧化酶活性在添加四環(huán)素處理中降低了8%～19%.此外,雖然土壤多酚氧化酶活性在不同土層之間沒(méi)有規(guī)律性的變化,但在添加四環(huán)素處理中的陽(yáng)極受到明顯的抑制(圖5b).多酚氧化酶作為典型的氧化還原酶可以促進(jìn)芳香族化合物的降解轉(zhuǎn)化,前人研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)土壤多酚氧化酶的活性會(huì)受到四環(huán)素的抑制,這意味著該酶在四環(huán)素降解過(guò)程中的作用相對(duì)較小[20].

土壤過(guò)氧化氫酶是評(píng)價(jià)污染土壤毒性狀況的指示酶[35],本研究中土壤過(guò)氧化氫酶活性主要受到四環(huán)素的抑制(圖4c).例如,與原始土壤相比,過(guò)氧化氫酶活性在未添加四環(huán)素處理(CN、CO 和CC 處理)并沒(méi)有顯著的變化,而當(dāng)過(guò)氧化氫酶暴露在四環(huán)素環(huán)境(TN、TO 和TC 處理)后,其活性顯著降低了16%～21% (P＜0.05),這與前人的研究結(jié)果一致[36-38].同時(shí),過(guò)氧化氫酶活性在添加四環(huán)素閉路處理的C層和A層較相應(yīng)的S層顯著提高了17%～26% (P＜0.05,圖5c),這與四環(huán)素在TC 處理S 層較高的殘留濃度一致.

圖4 不同處理間土壤酶活性變化Fig.4 Change of soil enzyme activities in different treatments

圖5 各處理不同層間土壤酶活性的變化Fig.5 Change of soil enzyme activities in different layered soils

漆酶是一種具有廣譜性降解能力的含銅多酚氧化酶,它能夠?qū)h(huán)境中的酚類(lèi)化合物催化為醌類(lèi)物質(zhì)或苯氧自由基[39-40].由圖4d 和圖5d 可知,與OS相比,土壤漆酶活性在實(shí)驗(yàn)處理中受到明顯的抑制,且在添加四環(huán)素后其活性進(jìn)一步被降低,這表明漆酶更偏好于好氧降解過(guò)程.

2.4 環(huán)境因子與微生物群落的冗余分析

采用冗余分析以探明四環(huán)素降解、土壤pH 值、電導(dǎo)率、酶活性與主要的屬水平微生物群落(包括細(xì)菌、真菌和古菌)之間的關(guān)系(圖6).微生物群落在不同處理中的變化規(guī)律參見(jiàn)文獻(xiàn)[19],相關(guān)數(shù)據(jù)已上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(SUB5067487, PRJNA516294).由圖6 可知,兩排序軸的總解釋度達(dá)80.48%,實(shí)線-空心箭頭代表解釋變量(包括四環(huán)素降解、土壤pH 值、電導(dǎo)率、酶活性),虛線-實(shí)心箭頭代表響應(yīng)變量(包括屬水平的細(xì)菌、真菌和古菌群落).本研究中,解釋變量共同解釋了96.4%的樣本信息,其中土壤pH 值對(duì)響應(yīng)變量的解釋度達(dá)到顯著水平(解釋度為21.5%,P＜0.05),說(shuō)明pH 值是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo).如圖6 所示,pH 值與四環(huán)素降解呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,這意味著四環(huán)素可能在偏酸性條件下更容易被降解.由圖還可知,四環(huán)素的降解率與土壤脫氫酶活性呈正相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步通過(guò)Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),兩者之間達(dá)極顯著水平(r=0.95, P＜0.01).Leng等[41]研究指出,四環(huán)素的生物降解途徑主要包括脫甲基、脫氫、脫羰基和脫氨基等過(guò)程.因此,在本研究中脫氫酶在四環(huán)素的脫氫過(guò)程中很可能起到了重要的作用.此外,數(shù)量過(guò)半的屬水平微生物與四環(huán)素降解和脫氫酶呈現(xiàn)出緊密相關(guān)關(guān)系,如Bacillus、Desulfocapsa 、 Scedosporium 、 Microascus 、Wardomyces 、 Aphanoascus 、 Chaetomium 、Aspergillus、Scopulariopsis、Geoalkalibacter 等.

圖6 土壤微生物群落與環(huán)境因子的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis between soil microbial community and environmental factors

產(chǎn)電呼吸是SMES 去除污染物質(zhì)的重要機(jī)制,在陽(yáng)極,污染物作為電子供體被生物氧化產(chǎn)生質(zhì)子(H+)和電子(e-),而H+和e-在胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)移速率將會(huì)決定污染物的去除效率[42].在呼吸鏈的氧化還原過(guò)程中,脫氫酶會(huì)參與代謝中間產(chǎn)物之間的H+轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生電位差,這將有利于生物電能的產(chǎn)生[43].在本研究中,脫氫酶活性的增加一方面可能會(huì)提升H+的轉(zhuǎn)移速率從而促進(jìn)四環(huán)素的去除效率;另一方面,由H+轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的電勢(shì)差提升了系統(tǒng)的電能輸出,這再度刺激了降解菌的代謝活性最終進(jìn)一步提升了對(duì)四環(huán)素的生物降解效率.

2.5 四環(huán)素的潛在降解功能菌

為了進(jìn)一步探明脫氫酶的潛在分泌菌,并揭示四環(huán)素的潛在降解微生物,通過(guò)Network 關(guān)聯(lián)分析對(duì)四環(huán)素降解率、脫氫酶活性和微生物群落之間的關(guān)系做了進(jìn)一步分析(圖7).由圖可知,屬水平微生物Microvirga 、 Staphylococcus 、 Lachnospiraceae NK4A136group、Geoalkalibacter、Microascus、Wardomyces 、 Aspergillus 、 Aphanoascus 和Scopulariopsis 與四環(huán)素降解之間存在較密切的聯(lián)系.其中,細(xì)菌變形菌門(mén)地桿菌科中Geoalkalibacter,真菌子囊菌門(mén)小囊菌科中Microascus、Wardomyces和 Scopulariopsis,以及同門(mén) Onygenaceae 科中Aphanoascus 的豐度隨四環(huán)素的添加而增加,并在電極的引入和生物電流的刺激下被進(jìn)一步提高[19].以Geoalkalibacter 和Microascus 為例,與無(wú)四環(huán)素對(duì)照(CN 處理)相比,它們的豐度在添加四環(huán)素后(TN 處理)分別增加了42%和50%,引入電極后(TO 處理)其豐度分別進(jìn)一步增加了152%和90%,在生物電流的刺激下(TC 處理)分別再度提高了7%和32%[19].

圖7 四環(huán)素降解率、脫氫酶活性和屬水平微生物之間的Network 分析Fig.7 Network analysis showing the connectedness among tetracycline degradation, dehydrogenase activity and microbial abundance at genus level

Geoalkalibacter 是常見(jiàn)的電活性微生物,通常富集于SMES 的陽(yáng)極區(qū)域參與產(chǎn)電過(guò)程[44-45].Hamdan等[46]研究表明,Geoalkalibacter 的存在更有利于多環(huán)芳烴的降解,這可能是因?yàn)镚eoalkalibacter 促進(jìn)了SMES 的產(chǎn)電性能,降解功能微生物的活性受到生物電流的刺激后進(jìn)一步促進(jìn)了污染物質(zhì)的降解.先前研究表明,Microascus 可促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)的降解[47], Microascus 和Wardomyces 在異丙甲草胺污染土壤中的富集證明了它們?cè)诮到猱惐撞莅愤^(guò)程中的重要作用[48].同時(shí),Scopulariopsis sp.在五氯苯酚污染土壤中起到了生物修復(fù)和生物防治的雙重功效[49].以上證據(jù)表明,Geoalkalibacter、Microascus、Wardomyces和Scopulariopsis在本研究中可能參與四環(huán)素的降解,且真菌子囊菌門(mén)中的小囊菌科在此過(guò)程中起到了主要的降解作用.由圖7 還可知,脫氫酶活性與屬水平真菌Microascus 和Scopulariopsis 之間關(guān)系密切,表明Microascus和Scopulariopsis很可能通過(guò)分泌脫氫酶從而促進(jìn)了四環(huán)素的脫氫過(guò)程.

3 結(jié)論

3.1 SMES 能夠有效去除土壤中殘留的四環(huán)素,其降解率較無(wú)電極對(duì)照增加35%(P＜0.05).土壤脫氫酶活性在染毒開(kāi)路和閉路處理中呈現(xiàn)出顯著的升高趨勢(shì),且與四環(huán)素降解率呈顯著正相關(guān)關(guān)系,而土壤過(guò)氧化氫酶活性受到四環(huán)素的顯著抑制.

3.2 Geoalkalibacter、Microascus、Wardomyces 和Scopulariopsis 是四環(huán)素的潛在降解菌,相比于細(xì)菌和古菌,真菌子囊菌門(mén)中的小囊菌科發(fā)揮了主要的四環(huán)素生物降解作用.其中,Microascus 和Scopulariopsis 很可能通過(guò)分泌脫氫酶從而促進(jìn)了四環(huán)素的脫氫過(guò)程.

3.3 土壤pH 值是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的重要理化指標(biāo),且與四環(huán)素降解呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,這意味著四環(huán)素可能在偏酸性環(huán)境中更易被降解.