基于核磁共振技術比較四川產(chǎn)厚樸根皮與干皮水提凍干粉的化學成分

韓 君 李厚聰 張志鋒 王曉彤 陳敬然 張志強

1.北京康仁堂藥業(yè)有限公司/北京市中藥配方顆粒工程技術研究中心，北京 101301；2.湖北民族大學醫(yī)學部，湖北 恩施 445000；3.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041

厚樸藥材規(guī)格等級標準中，按來源將厚樸劃分為溫樸和川樸2種，按取皮部位再劃分為4種規(guī)格筒樸、蔸樸、根樸、枝樸，每一種規(guī)格又按長度和質(zhì)量劃分一等、二等、三等、四等若干等級[1-2]。厚樸規(guī)格等級劃分主要是以性狀特征、特征圖譜、揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性化學成分差異為依據(jù)[3]，然而特征圖譜需要大量標準品以及現(xiàn)有研究缺少對厚樸相關化合物的多級質(zhì)譜裂解途徑及其規(guī)律的研究，操作性不強，揮發(fā)性成分由于其成分復雜, 其中性質(zhì)相似的組分保留時間較為接近, 色譜峰重疊嚴重, 較難準確定性和定量[4]；依據(jù)性狀特征劃分商品規(guī)格等級，這種方法是否有科學內(nèi)涵又值得商榷[5]。

核磁共振技術(NMR)具有良好的分析復雜成分的能力，近年來廣泛應用于代謝組學和復雜成分分析，并取得了良好的效果[6-8]，其中有少數(shù)文獻報道采用一維NMR光譜對厚樸進行相關研究[9]，但一維NMR方法譜峰分離不佳譜圖上識別不了更多的化學基團，二維NMR譜除了包含一維NMR譜中的信息，還含有更多的結構信息[10]。本研究應用核磁共振技術1HNMR、13CNMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC對四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉進行化學成分分析，彌補了化學分析中特征圖譜需要大量標準品以及現(xiàn)有研究缺少對厚樸相關化合物的多級質(zhì)譜的裂解途徑及其規(guī)律的研究。臨床中厚樸入藥的形式多為水煎煮湯劑，故本研究對水提物化學成分進行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與軟件 Bruker AVANCEII500MHz超導脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)，5 mm核磁管(美國Norell公司)；臺式高速離心機(德國Sigma公司)；BSA124S型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)；Spectrum Two FI-IR Spectrometer(PerkinEImer公司)；NMR譜圖通過Bruker Topspin 4.0.8及MestReNova 9.0.1軟件處理。

1.2 材料與試劑 收集四川省共8份厚樸樣本，由西南民族大學張志鋒教授鑒定為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.，詳細信息見表1；氘代二甲基亞砜 (DMSO-d6)購自美國CIL公司。

表1 四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮樣品信息以及厚樸酚與和厚樸酚的HPLC含量測定

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 稱取厚樸樣品60 g置于圓底燒瓶中加水1000 mL，加熱回流1 h，提取液于65 ℃減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥，取固體粉末10 mg至NMR樣品管中，加入氘代二甲基亞砜0.6 mL溶解，3500 r/min離心5 min，移液槍取上清液轉(zhuǎn)移至NMR樣品管中用于實驗。

1.3.2 NMR實驗條件1H和13C-NMR的工作頻率分別為500.13和125.95 MHz，實驗溫度為25 ℃，譜寬分別為12376.24和35971.22 Hz。1H-1H COSY和1H-13C HSQC實驗分別采用COSYGPMFQF和HSQCEDETGPSI標準脈沖程序。1H-1H COSY的F2維(1H)和F1維(1H)譜寬均為5000Hz，采樣數(shù)據(jù)點陣t2×t1=2048×256，累加次數(shù)為16；HSQC的F2維(1H)和F1維(13C)譜寬分別為5000 Hz和25155 Hz，采樣數(shù)據(jù)點陣t2×t1=1024×256，累加次數(shù)為16[11]。NMR譜圖通過Bruker Topspin 4.0.8及MestReNova 9.0.1軟件處理。

2 結果與分析

2.1 厚樸根皮水提凍干粉的UV與IR分析 厚樸根皮水提物的紫外吸收光譜的譜圖上(圖1)可以清晰見到兩個吸收帶，205 nm為強吸收帶(K帶)，是分子中共軛烯烴的吸收帶，屬于π→π*躍遷。284 nm為弱吸收帶(R帶)，是分子中羰基的吸收帶，屬于n→π*躍遷。紅外吸收光譜在波數(shù)3381、1075 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羥基；在波數(shù)2932、1413 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有亞甲基和甲基；在波數(shù)1608 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羰基基團；在波數(shù)1506、914 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有烯烴；在波數(shù)1270、1230 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有醚鍵；在波數(shù)820 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有苯環(huán)；3150～3260 cm-1區(qū)間應該還有一個vC=C-H烯烴碳氫的伸縮振動；在990 cm-1附近未出現(xiàn)一個明顯的端烯的特征峰，從該譜圖推知(圖2)，含有magnoloside B類似物的特征峰，同樣也含有厚樸酚類似物的羥基、烯烴、亞甲基、苯環(huán)等特征峰。

2.2 厚樸根皮水提凍干粉的NMR分析 根皮水提凍干粉的核磁測試溶劑：氘代DMSO-d6。它的核磁共振氫譜(圖3)信號盡管比較復雜，但依然可辨相對主要的信號。它的氫譜在芳香區(qū)域顯示一組典型的1,2,4-三取代苯環(huán)信號：6.93 (2H, m)、6.79 (1H, d,J=8.8 Hz)，在烯烴信號區(qū)域檢測到一組乙烯基：5.93 (1H, m)、5.06 (1H,br d,J=17.0 Hz)、5.00 (1H, br d,J=10.0 Hz)，此外在高場區(qū)檢測到一個積分值為兩個氫的寬雙峰信號：3.27 (2H, br d,J=6.7 Hz)。它的碳譜(圖4)也檢測到一系列信號，借助二維核磁HSQC信號(圖5)，可辨識高場區(qū)一個亞甲基碳信號：38.7；源于乙烯基的兩個碳：115.1、138.2；苯環(huán)上的三個次甲基碳：115.9、127.8、131.1。在二維核磁1H,1H-COSY譜中(圖6)，觀察到高場處的那個亞甲基雙峰信號與乙烯基氫信號均有相關，以及苯環(huán)上由于3J耦合而產(chǎn)生的相關信號?；谏鲜鲆痪S、二維核磁圖譜的仔細分析，可得出該結構中含有苯丙素結構單元，考慮到厚樸已報道化學成分的結構特點，提示該結構存在對稱因素——即完全對稱的苯丙素二聚體，調(diào)研相關文獻中的核磁數(shù)據(jù)，最終確定上述核磁信號與厚樸酚結構(1)(圖7)是吻合的。

此外，在氫譜中還檢測到一組微量的、但是可以辨識的反式烯氫信號：6.30 (1H, d,J=15.8 Hz)、7.47 (1H, d,J=15.8 Hz)，提示很可能來源于肉桂?；?；在高場區(qū)可見雙峰甲基信號：1.12 (3H, d,J=6.0 Hz)，借助HSQC譜可知該甲基的碳信號位于17.8 ppm，在1H,1H-COSY譜觀察到該甲基雙峰與3.77的連氧氫信號有耦合，提示微量成分中很可能含有鼠李糖片段。在氫譜的3.0～4.0 ppm、碳譜的60～85 ppm區(qū)間可見若干來源于糖上的信號，氫碳譜的芳香區(qū)也有若干信號，考慮到厚樸已報道化學成分的結構特點，調(diào)研相關文獻中的核磁數(shù)據(jù)，推測根皮水提凍干粉中還含有微量的苯乙醇苷類成分，如magnoloside A、magnoloside B。但由于在提取物中的占比相對微量，尚不能做到準確的定性。

四川產(chǎn)厚樸根皮水提凍干粉的主要成分是厚樸酚，微量成分為苯乙醇苷類。

2.3 厚樸干皮水提凍干粉的UV與IR分析 厚樸干皮水提取的紫外吸收光譜的譜圖上(圖1)可以清晰見到三個吸收帶，204 nm為強吸收帶(K帶)，是分子中共軛烯烴的吸收帶，屬于π→π*躍遷。284 nm為弱吸收帶(R帶)，是分子中羰基的吸收帶，屬于n→π*躍遷。322 nm為弱吸收帶(R帶)，是分子中共軛羰基的吸收帶，共軛結構使能量下降，吸收光發(fā)生了紅移，屬于n→π*躍遷。紅外吸收光譜在波數(shù)3393、1074 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羥基；在波數(shù)2934、1418 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有亞甲基和甲基；在波數(shù)1607 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羰基基團；在波數(shù)1516 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有烯烴；在波數(shù)1269 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有醚鍵；在波數(shù)814 cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有苯環(huán)。該紅外譜圖中同樣能在3150～3260 cm-1區(qū)間觀察到一個被掩蓋掉的強吸收峰，在990 cm-1附近細看可隱約觀察到一個待出的的端烯峰，從該譜圖(圖2)推知，含有magnoloside B類似物的特征峰，同樣也含有厚樸酚類似物的羥基，烯烴，亞甲基，苯環(huán)等特征峰以及隱約的端烯峰，因此該譜圖應含有magnoloside B及厚樸酚類似物。

2.4 厚樸干皮水提凍干粉的NMR分析 干皮水提凍干粉的核磁測試溶劑：氘代DMSO-d6。在氫譜(圖3)中檢測到一組特征性的反式烯氫信號：6.30 (1H, d,J=15.8 Hz)、7.47 (1H, d,J=15.8 Hz)，在6.55～7.15 ppm區(qū)間可見多組苯環(huán)的1,2,4-三取代芳氫信號，在3.6～4.0 ppm未見芳甲醚信號，可推斷上述信號來源于咖啡?；?；在高場區(qū)檢測到雙峰甲基信號：1.12 (3H, d,J=6.0 Hz)，借助HSQC譜(圖5)確定該甲基的碳信號位于17.7 ppm，在1H,1H-COSY譜(圖6)觀察到該甲基雙峰與3.78的連氧氫信號有耦合，提示了鼠李糖片段的存在。在氫譜的2.63 ppm處檢測到連苯環(huán)的亞甲基信號，通過HSQC譜確定該亞甲基的碳信號位于35.1 ppm，在1H,1H-COSY譜中觀察到該亞甲基氫與3.52/3.80處有相關，可初步推斷為苯乙醇苷類。在氫譜的5.53 ppm處檢測到一個耦合常數(shù)為2.9 Hz的三重峰，這是吡喃阿洛糖C-3位氫的診斷性信號，大幅度低場位移提示了阿洛糖的C-3位羥基與咖啡酸成酯。此外，在4.0～5.0 ppm區(qū)間可見多個阿洛糖端基氫、葡萄糖端基氫以及鼠李糖端基氫信號，前兩者為耦合接近8 Hz的雙峰，后者呈現(xiàn)寬單峰，在氫譜的3.0～4.0 ppm、碳譜的60～85 ppm區(qū)間可見若干來源于糖上的信號?？紤]到厚樸已報道化學成分的結構特點，調(diào)研相關文獻中的核磁數(shù)據(jù)，可確定干皮水提凍干粉中富含苯乙醇苷類成分，如magnoloside A、magnoloside B或它們的結構類似物。由于該類成分的核磁信號異常復雜，又是多個類似結構的混合物，未能確定具體的苯乙醇苷類成分的化學結構。

此外，它的核磁共振氫譜中在烯烴信號區(qū)域依稀可辨一組乙烯基：5.93 (1H, m)、5.06 (1H, br d,J=17.0 Hz)、5.00 (1H, br d,J=10.0 Hz)，這是厚樸酚的特征性信號。盡管信號非常微弱，但對它的結構定性是可靠的。

四川產(chǎn)厚樸干皮水提凍干粉富含苯乙醇苷類成分，此外依稀可見微量的厚樸酚。

2.5 四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉NMR變量數(shù)據(jù)差異性檢驗 選擇SPSS軟件對四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉NMR變量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用平方歐式距離作為厚樸根皮和干皮間距離的計算方式。

由表2可知，P值為0.987，大于0.05，故根皮組內(nèi)的的數(shù)據(jù)沒有差異性。

由表3可知，P值為0.976，大于0.05，故干皮組內(nèi)的的數(shù)據(jù)沒有差異性。

表2 厚樸根皮NMR差異性檢驗結果

表3 厚樸干皮NMR差異性檢驗結果

由表4可知，在萊文方差等同性檢驗中，P值為0.134，大于0.05，所以選擇等方差的數(shù)據(jù)。在平均值等同性t檢驗中，P值為0.012，小于0.05，所以可以認為根皮和干皮組之間存在差異。四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉聚類分析結果如圖8所示。

表4 厚樸根皮和干皮兩種規(guī)格NMR差異性檢驗結果

3 討論與結論

3.1 討論 常規(guī)1H-NMR中水峰信號很強，溶劑信號雖然弱些，但相對于除水峰以外的其它信號仍然很大。上述信號不僅直接影響了對所處區(qū)域其它信號的觀測，更主要是由于水峰和溶劑信號構成了核磁共振中自由衰減信號的主體，必然會抑制低濃度組分信號的信噪比改善[12]。

預飽和方法是所有壓制水峰的方法中最方便，效果也最好的方法。針對樣品的自身特殊性和實驗的目的要求，確定了以雙溶劑預飽和脈沖序列為獲取1H-NMR圖譜的技術手段，該脈沖序列具有對多組信號進行選擇性壓制功能[12]如圖9所示。脈沖序列：RD-90°-t1-90°-tm-90°-FID參數(shù)：t1為2.4s、混合時間tm為100 ms、譜寬10000 Hz、累加次數(shù)為32。

3.2 結論 本實驗對四川產(chǎn)厚樸根皮與干皮水提凍干粉進行紅外吸收光譜(IR)、紫外吸收光譜(UV)及核磁共振(NMR)波譜(包括1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC)進行了測定，分析了其UV和IR譜圖特征吸收峰對應的基團，并對其1H NMR和13C NMR信號進行了歸屬，上述波譜學數(shù)據(jù)說明了四川產(chǎn)厚樸根皮水提凍干粉的主要成分是厚樸酚，微量成分為苯乙醇苷類，厚樸干皮水提凍干粉富含苯乙醇苷類成分，此外依稀可見微量的厚樸酚，其中水溶性成分苯乙醇苷被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于厚樸之中，并由于其突出的生物活性而引起了更多的關注，比如止痙攣的作用、酶抑制效果、抗氧化性[13]。值得注意的是，在早期研究中，苯乙醇苷和厚樸苷A均在胃腸功能障礙動物模型中均表現(xiàn)出明顯的療效[14]，這意味著苯乙醇苷可能有助于厚樸藥材發(fā)揮臨床效果。因此，明確了厚樸干皮與根皮生物活性成分差異，為合理選擇厚樸不同藥用部位作為原材料開發(fā)不同功效的藥物提供參考。同時該研究為建立中藥厚樸不同規(guī)格核磁共振化學信息提供參考資料，亦為中藥厚樸規(guī)格等級標準制定提供基礎資料。