維吾爾藥材菠菜子的DNA條形碼鑒定及質(zhì)量控制研究

沙拉麥提·艾力 汪 波 陳亞飛 佟瑞敏 謝 莉 梅之南 熊 慧*

1.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830002；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430012；3.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074

菠菜子為藜科菠菜屬植物菠菜SpinaciaoleraceaL的干燥成熟果實(shí)，原產(chǎn)伊朗，在我國各地普遍栽培，其標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊》1998年版。在新疆，菠菜子作為傳統(tǒng)的維吾爾醫(yī)用藥材，有調(diào)節(jié)異常膽液質(zhì)，退熱利尿，通便止痛之功效，常用于異常膽液質(zhì)過盛，發(fā)燒不退，體弱，便秘，小便不利等病癥[1-4]?！吨腥A本草》記載，菠菜子含小龍骨素(polypodine)，β-蛻皮甾酮(20-hydroxyecdysone)，α-菠菜甾醇(α-spinasterol)，豆甾烯醇(stigmastenol)和豆甾烷醇(stigmastanol)等成分[5]。

菠菜子的文獻(xiàn)研究資料相對(duì)較少，其藥材基原鑒定和質(zhì)量控制的相關(guān)研究未見報(bào)道，目前菠菜子的鑒別主要依靠人用經(jīng)驗(yàn)以及顯微鑒別等基礎(chǔ)鑒別手段鑒定，這些方法雖然操作簡單，但具有較大的主觀性，鑒定人員也需要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此，急需一個(gè)能夠整體評(píng)價(jià)菠菜子藥材質(zhì)量并對(duì)其進(jìn)行有效控制的科學(xué)分析方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA條形碼已成為近年來國際上生物多樣性研究的熱點(diǎn)，能有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的不足，區(qū)分親緣關(guān)系較近的物種[6]。指紋圖譜可以整體、宏觀的表征被測樣品主要化學(xué)成分的特征，經(jīng)過多年的發(fā)展和應(yīng)用，目前是公認(rèn)的最適合中藥及天然藥物物質(zhì)群質(zhì)量控制的手段之一[7]。為了更好的控制菠菜子藥材的質(zhì)量，本研究對(duì)收集到的10批菠菜子藥材進(jìn)行了初步的DNA條形碼分子鑒定研究，并結(jié)合HPLC指紋圖譜研究和指標(biāo)性成分β-蛻皮甾酮的HPLC含量測定研究，以期建立菠菜子的快速鑒定和質(zhì)量控制方法，為更好的控制維吾爾族藥材菠菜子的質(zhì)量提供參考。

1 儀器、試藥及樣品

1.1 儀器 Bio-Rad T100型PCR儀(Bio-Rad公司)，DYY-6C型凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，JX-FSTPRP-24型全自動(dòng)樣品快速研磨儀(天津市泰斯特儀器有限公司)，Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司，DAD檢測器)，Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；美國Agilent公司)，SYZ F 10L型超純水制造系統(tǒng)(成都滲源科技有限公司)；CP214電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 快捷型植物基因組提取試劑盒(DP321，天根生化科技有限公司)；鑒別引物委托由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。甲醇(美國TEDIA，批號(hào)：20171017，色譜純)，磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20181019，分析純)，超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。β-蛻皮甾酮對(duì)照品(批號(hào)：wkq19011007，四川省維克奇生物科技有限公司)。

1.3 樣品 菠菜子樣品于2016～2018年在新疆全區(qū)共收集，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院劉新橋副教授鑒定，為藜科菠菜屬植物菠菜S.oleracea的干燥果實(shí)。

表1 菠菜子樣品信息

2.1 模板 DNA提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)及PCR產(chǎn)物檢測參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定法”(《中國藥典》2015年版四部通則9107)。本研究利用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，采用NanoDrop 2000(Thermo Scientific，USA)測定OD260/OD280比值及DNA濃度。PCR擴(kuò)增及測序的正向引物為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物為5′-GACGCTTCTCCAGA CTACAAT-3′。30 μLPCR反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液3 μL，二氯化鎂(25 mM) 2.4 μL，dNTP(10 mm)0.6 μL，鑒別引物(30 μmol/L)各 0.5 μL，高保真Taq DAN聚合酶(5U/μL)0.2 μL，模板1 μL，無菌超純水21.8 μL。將離心管置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性4 min，循環(huán)反應(yīng)30次(95 ℃ 30 s，55～58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化后使用ABI3730XL測序儀雙向測序，測序峰圖利用CodonCode Aligner V3.7.1(CodonCode Co., USA)校對(duì)拼接，將所有序列用軟件MEGA 6.05分析比對(duì)，并用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支支持率。

2.2 菠菜子及其近緣物種系統(tǒng)鄰接(NJ)樹鑒別 菠菜ITS2序列數(shù)據(jù)來自收集樣品和NCBI數(shù)據(jù)庫；近緣物種ITS2序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫。菠菜子ITS2實(shí)驗(yàn)序列比對(duì)后長度均為214bp，所獲得的序列中沒有變異位點(diǎn)?；贗TS2序列構(gòu)建藜科菠菜屬菠菜子及同科濱藜屬植物Atriplexsuberecta(Genbank No.GQ465766.1, HM005862.1)、A.rosea(Genbank No.:HM005858.1)、A.hortensis(Genbank No.:HM005854.1)、A.dioica(Genbank No.:MG235264.1)、A.australasica(Genbank No.:EU331095.1)、A.praecox(Genbank No.:KX16675.1)、A.halimus(Genbank No.:KU555433.1)、A.cinerea(Genbank No.:HM005864.1)、A.rusbyi(Genbank No.:HM005865.1)、A.peruviana(Genbank No.:HM005867.1)、A.canescens(Genbank No.:FJ601827.1)、A.torreyi(Genbank No.:FJ601839.1)，甜菜屬植物Betanana(Genbank No.:KP748063.1)、B.macrocarpa(Genbank No.:KP748157.1, KP748168.1)、B.vulgaris(Genbank No.:KP748111.1)，鹽節(jié)木屬植物Halocnemunstrobilaceum(Genbank No.:AY489241.1, KX282176.1)，鹽千屈菜屬植物Halopeplisamplexicaulis(Genbank No.:AY489237.1)、H.perfoliata(Genbank No.:MH547482.1)，棉藜屬植物Kirilowiaeriantha(Genbank No.:AY489209.1)，霧冰藜屬植物Bassiamuricata(Genbank No.:AY489198.1)、B.prostrata(Genbank No.:AY489216.1,HM630029.1)、B.eriophora(Genbank No.:KX282036.1,KX282034.1)、B.indica(Genbank No.:HM630026.1)、B.scoparia(Genbank No.:AY489218.1, FJ599757.1)，兜藜屬植物Panderiapilosa(Genbank No.:AY489227.1, DQ499335.1)，絨藜屬植物L(fēng)ondesiaeriantha(Genbank No.:AY489220.1)的NJ樹。結(jié)果表明濱藜屬、波菜屬、甜菜屬、鹽節(jié)木屬、鹽千屈菜屬、棉藜屬分別聚為一支。菠菜子ITS2序列單獨(dú)聚為一支分支支持率達(dá)100%，表現(xiàn)出較好的單系性，能與同科近緣物種較好區(qū)分。ITS2序列可作為DNA條形碼用于菠菜子及其近緣物種的準(zhǔn)確鑒定。如圖1所示。

3 指紋圖譜

3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C184.6 mm×250 mm 5 μm；流動(dòng)相：甲醇(A)—0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，10% A；10～20 min，10%→30% A；20～40 min，30%→40% A；40～65 min，40%→80% A)，流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：240 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 精密度試驗(yàn) 取“3.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：S1)按“3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。以5號(hào)色譜峰為參照，經(jīng)計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.9%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.1%，表明儀器的精密度良好。

3.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次菠菜子樣品(批號(hào)：S1)6份，按“3.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，記錄色譜圖。以5號(hào)色譜峰為參照，經(jīng)計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.5%，表明方法的重復(fù)性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性 取菠菜子樣品(批號(hào)：S1)按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以5號(hào)色譜峰為參照，經(jīng)計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 不同產(chǎn)地菠菜子指紋圖譜的建立 取10批菠菜子樣品，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“3.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2012.130723 版本”軟件進(jìn)行分析，以S1為參照?qǐng)D譜，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法選擇中位數(shù)法，選擇時(shí)間寬度0.5，生成對(duì)照指紋圖譜R，確定了7個(gè)共有峰，10批不同來源菠菜子指紋圖譜如圖2所示。各批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為 0.969、0.982、0.958、0.997、0.983、0.983、0.994、0.996、0.996、0.976，相似度計(jì)算結(jié)果均大于0.950，表明相似度良好。

根據(jù)10批菠菜子的指紋圖譜匹配結(jié)果，共匹配成功7個(gè)共有指紋峰，經(jīng)過與β-蛻皮甾酮對(duì)照品比對(duì)定位，標(biāo)定出1個(gè)色譜峰，為β-蛻皮甾酮(5號(hào)峰)，如圖3所示。

4 菠菜子中β-蛻皮甾酮含量測定HPLC方法學(xué)研究

4.1 溶液的制備

4.1.1 對(duì)照品溶液 取β-蛻皮甾酮對(duì)照品適量，精密稱定，加50% 甲醇制成每1 mL含β-蛻皮甾酮40 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

4.1.2 供試品溶液 取本品(批號(hào)：S1)粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(0.45 μm濾膜過濾)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

4.2 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C184.6mm × 250 mm 5 μm；流動(dòng)相：甲醇(A)—0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，45%→40%A；15～25 min，40%→80% A；25～30 min，80%→45% A；30～45 min，45% A)，流速： 1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：248 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算應(yīng)不低于5000。

4.3 系統(tǒng)適用性 取“4.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，重復(fù)測定6次，要求6次所得色譜圖中峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)符合規(guī)定要求(RSD不得大于2.0%)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：重復(fù)進(jìn)樣6 針的系統(tǒng)適用性溶液中，理論塔板數(shù)按β-蛻皮甾酮峰計(jì)算平均值為6902；β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為0.09%，結(jié)果符合系統(tǒng)適用性要求。

4.4 專屬性試驗(yàn)

4.4.1 分離度考察 分別取“4.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，“4.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，供試品中β-蛻皮甾酮峰與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，且與相鄰峰的分離度大于1.5，色譜圖如圖4所示。

4.4.2 供試品 溶液配制方法的考察本研究參照《中國藥典》2015年一部及相關(guān)文獻(xiàn)資料中β-蛻皮甾酮HPLC檢測方法中的供試品提取方法，分別以甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇為提取溶劑，設(shè)計(jì)了超聲和回流兩種提取方法，考察不同的提取溶劑及不同提取方法對(duì)含量測定的影響。

取本品(批號(hào)：S6)粉末(過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按表2設(shè)計(jì)的提取溶劑和提取方法，分別配置供試品溶液。另取β-蛻皮甾酮對(duì)照品適量，按“4.1.1”項(xiàng)下的方法配置對(duì)照品溶液，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，計(jì)算各提取溶劑和提取方法中β-蛻皮甾酮的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表2)顯示，以50%甲醇和50%乙醇作為提取溶劑效果最好，且回流的效果明顯要好于超聲的效果，為避免檢測時(shí)溶劑峰的干擾，最后選擇以50%甲醇回流提取30 min作為本品的供試品溶液配制方法。

4.5 檢測限和定量 限取“4.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，倍比稀釋，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)得檢測限；當(dāng)信噪比為10∶1得定量限。檢測結(jié)果顯示，β-蛻皮甾酮的檢測限為1.4 ng，定量限為4.1 ng。

4.6 線性及范圍 取β-蛻皮甾酮對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含β-蛻皮甾酮1 mg的溶液，作為線性實(shí)驗(yàn)對(duì)照品貯備液，備用。分別取線性實(shí)驗(yàn)對(duì)照品貯備液0.15、0.25、0.50、1.0、1.5、2.5、3.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的系列線性對(duì)照品溶液。取各不同濃度的線性對(duì)照品溶液，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測。以各濃度對(duì)照品溶液峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=14.078X+8.979(r=0.9997)，在6.115～122.304 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，試驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定要求。

表2 供試品溶液配制方法考察試驗(yàn)結(jié)果

4.7 精密度試驗(yàn) 取“4.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件檢測，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄色譜圖，測得β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為0.10%，表明儀器精密度良好。

4.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)：S1)，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。β-蛻皮甾酮的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.04%，符合規(guī)定要求，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次菠菜子樣品(批號(hào)：S1)6份，按“4.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，記錄色譜圖，測得β-蛻皮甾酮平均含量為0.97%，RSD為0.22%，表明方法重復(fù)性良好。

4.10 加樣回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的同一批次(批號(hào)：S1)菠菜子樣品，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入適量的β-蛻皮甾酮對(duì)照品溶液，按“4.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果β-蛻皮甾酮平均回收率為98.92%，RSD為1.49%，表明本方法的回收率良好，見表3。

4.11 樣品含量測定 取10批菠菜子樣品，按“4.1.1”項(xiàng)的方法制備對(duì)照品溶液、按“4.1.2”項(xiàng)下的方法分別制備供試品溶液，按“4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，計(jì)算10批樣品中的β-蛻皮甾酮的含量，檢測結(jié)果見表4。

表3 回收率測試結(jié)果

表4 樣品含量測定結(jié)果

5 討論

相比中藥材，維吾爾藥材來源更為復(fù)雜，在長期的用藥過程中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還有待進(jìn)一步提高，藥材監(jiān)管難度頗大[8]。DNA條形碼鑒定方法不依賴于專業(yè)人員的主觀經(jīng)驗(yàn)以及植物的形態(tài)特征，不受時(shí)間、氣候等外界因素的影響，針對(duì)物種的遺傳信息進(jìn)行鑒定，因其操作簡便、快捷，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確可靠在中藥材鑒定中廣泛應(yīng)用[9]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，菠菜子ITS2序列單獨(dú)聚為一支分支，具有良好的單系性，能與同科近緣物種較好區(qū)分，使用ITS2序列即能實(shí)現(xiàn)維吾爾藥材菠菜子及其同科近緣物種的鑒定，建立的DNA條形碼技術(shù)可以追溯藥材的基原，快速準(zhǔn)確的鑒定維吾爾藥材菠菜子，在今后藥材來源、標(biāo)準(zhǔn)制定、藥材流通和市場管理等實(shí)際應(yīng)用中具有重要的價(jià)值。

菠菜子在維醫(yī)理論中具有清利異常膽液質(zhì)、退熱利尿、通便止痛之功效[1]，現(xiàn)代藥理研究[11]發(fā)現(xiàn)菠菜子的水溶液能有效抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹，緩解大鼠的棉球肉芽腫。β-蛻皮甾酮(蛻皮激素)作為是菠菜子藥材的主要化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞體外增殖誘導(dǎo)成骨分化，并能通過介導(dǎo)β鏈蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善骨關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)軟骨損傷[12-14]，與菠菜子的傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代抗炎作用相吻合。本研究首次建立10批不同來源菠菜子藥材的 HPLC 指紋圖譜，共標(biāo)定出7個(gè)共有峰，并以主要化學(xué)成分β-蛻皮甾酮(5號(hào)峰)為參照峰，10批菠菜子藥材的相似度均在0.9以上，所得圖譜可以表征菠菜子藥材的特征屬性，可用于菠菜子藥材的鑒定，亦為對(duì)菠菜子更準(zhǔn)確全面的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

在指標(biāo)性成分β-蛻皮甾酮含量測定的方法學(xué)研究中，本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)：①在其他色譜條件不變的情況下，考察流速為0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min時(shí)對(duì)-蛻皮甾酮分離效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，β-蛻皮甾酮色譜峰的出峰時(shí)間適中，對(duì)稱性及分離度較最好。②在其他色譜條件不變的情況下，考察柱溫為 28 ℃、30 ℃、32 ℃時(shí)對(duì)β-蛻皮甾酮分離效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)柱溫為 28～32 ℃ 時(shí)，各主要色譜峰的峰型、分離度差異不大，結(jié)合實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，最終選擇常用的30 ℃作為色譜柱柱溫。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，適合用于菠菜子中β-蛻皮甾酮的含量測定。