長鏈非編碼RNA TTN-AS1通過miR-3928調(diào)節(jié)p38MAPK參與宮頸癌進展的機制研究

劉曉娟，謝雙雙，張 晶，康燕華

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北張家口 075002

盡管新的診斷技術(shù)和治療方法不斷被應(yīng)用于臨床，但是宮頸癌患者的預(yù)后仍然不令人滿意。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是引起宮頸癌患預(yù)后不佳的主要因素，p38MAPK由MAPK14基因編碼，是引起宮頸癌進展、轉(zhuǎn)移的重要蛋白[1]，但是其具體的調(diào)控機制尚不完全明確。最新研究證實了微小RNA(miRNA)與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，miRNA可通過直接靶向靶基因的信使RNA(mRNA)誘導(dǎo)其講解或轉(zhuǎn)錄抑制，從而轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達從而參與腫瘤的發(fā)展[2]。miR-3928是近年來新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的miRNA，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-3928的水平可以促進骨肉瘤的進展，提示miR-3928具有抑癌作用[3]，但是miR-3928在宮頸癌中的作用尚不清楚。此外，miRNA的靶向作用又被長鏈非編碼RNA(LncRNA)的靶向調(diào)控，LncRNA會像“海綿”一樣吸附miRNA從而調(diào)控靶基因的表達[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)TTN-AS1可通過靶向miR-4677-3p促進ZEB1基因的表達，從而發(fā)揮促進肺腺癌細胞遷移和侵襲[5]。本研究主要分析RNA TTN-AS1通過miR-3928 調(diào)節(jié)p38MAPK參與宮頸癌進展的機制。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌細胞系CasKi(ATCC公司，美國)。DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)。miR-3928類似物(mimic)、TTN-AS1和p38MAPK過表達質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對照(NC)(Thermo Fisher公司，美國)。Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)。雙熒光素酶報告試劑盒和相應(yīng)的熒光檢測儀(Promega公司，美國)。細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)試劑盒(Beyotime生物技術(shù)研究所，中國)。凋亡檢測試劑盒和FACSCaliburTM流式細胞儀(BD Biosciencesg公司，美國)。Transwell小室和基質(zhì)凝膠(BD Biosciences公司，美國)。PCR引物由Genewiz公司(中國)設(shè)計和合成。Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司，瑞士)。ABI 7500 PCR檢測系統(tǒng)(Life technology公司，美國)。 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液(Beyotime公司，中國)。二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(北京Applygen公司，中國)。p38MAPK、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和二抗(Abcam公司，美國)。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司，美國)。

1.2生物信息學(xué)分析 通過工具網(wǎng)站GEPIA分析腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫的宮頸癌患者TTN-AS1水平與宮頸癌進展情況和與MAPK14水平之間的關(guān)系。預(yù)測TTN-AS1靶向miR-3928和miR-3928靶向p38MAPK的結(jié)合位點。

1.3雙熒光素酶報告實驗 將細胞分為對照組和miR-3928模擬組(mimic組)，并分別通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NC和miR-3928mimic。在驗證miR-3928靶向p38MAPK時，分別將野生型的p38MAPK(p38MAPK-wt)或突變的p38MAPK(p38MAPK-mut)克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。然后分別通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)或蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblot)檢測各組miR-3928和p38MAPK的水平。

在驗證TTN-AS1時靶向miR-3928時，分別將TTN-AS1-wt和TTN-AS1-mut克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。將CasKi細胞接種在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000將克隆和突變的序列轉(zhuǎn)染至細胞中。使用熒光素酶報告檢測儀評估熒光素酶活性。

1.4qPCR檢測TTN-AS1、miR-3928和p38MAPK mRNA 通過Trizol獲得細胞中總RNA，然后驗總RNA的純度和濃度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進行qPCR實驗(在95 ℃ 10 min，40個循環(huán)，94 ℃ 15 s，60 ℃/1 min，60 ℃ 1 min，4 ℃保存)。GAPDH作為mRNA和LncRNA的內(nèi)參，U6作為miRNA的內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達。

1.5Westernblot檢測p38MAPK蛋白的表達 在液氮下將細胞研磨，在液氮保護下使用RIPA裂解緩沖液裂解，并使用BCA蛋白測定試劑盒測量總蛋白含量。然后使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(50 V,120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PVDF膜與一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃孵育過夜，然后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內(nèi)參對蛋白條帶的灰度進行定量。

1.6細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 將CasKi細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃。5% CO2，相對濕度100%。將細胞分為4組，即對照組、mimic組、mimic+TTN-AS1組和TTN-AS1組。使用Lipofectamine 2000試劑盒進行瞬時轉(zhuǎn)染，其中mimic組和mimic+TTN-AS1組通過轉(zhuǎn)染miR-3928 mimic質(zhì)粒以過表達miR-3928，mimic+TTN-AS1組和TTN-AS1組轉(zhuǎn)染p38MAPK質(zhì)粒過表達p38MAPK。對照組轉(zhuǎn)染兩種NC質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞進行后續(xù)試驗。

1.7CCK-8檢測細胞活力 將細胞接種于96孔板(每孔2×104個細胞，100 μL)，在培養(yǎng)第48 h加入10 μL CCK-8試劑并在37 ℃下培養(yǎng)，通過酶標儀檢測450 nm處的吸光度計算相對細胞活力。

1.8流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將細胞消化后重懸，在2×105個細胞中分別加入異硫氰酸熒光素(FITC) Annexin V和7-氨基放線菌素D(7-AAD)各10 μL和5 μL，然后分別室溫、避光下分別孵育15 min，然后通過進行流式細胞術(shù)，通過配套Cell Quest軟件分析凋亡率。

1.9荷瘤裸鼠實驗 在Transwell小室的上室加入基質(zhì)膠，底室加入完全培養(yǎng)基，然后將2×104個細胞加入至上室培養(yǎng)48 h。48 h后洗去未侵入底室的細胞。然后將細胞使用20%甲醇固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下計數(shù)每個視野侵入底部室的細胞數(shù)目。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析結(jié)果 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)GEPIA的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)高水平的TTN-AS1的宮頸癌患者具有更短的無進展生存期(P<0.05)，并且TTN-AS1的水平與MAPK14的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)(r=0.320,P<0.05)。見圖1。

注：A為GEPIA數(shù)據(jù)庫中TTN-AS1表達與宮頸癌患者無進展生存期的相關(guān)性;B為GEPIA數(shù)據(jù)庫中TTN-AS1表達與MAPK14表達的相關(guān)性；TPM為每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts；HR為生存資料的效應(yīng)量，比較一段時間內(nèi)的風(fēng)險。

2.2TTN-AS1直接靶向miR-3928 TTN-AS1靶向miR-3928的結(jié)合位點見圖2。然后通過雙熒光霉素試驗結(jié)果驗證了同時轉(zhuǎn)染NC+TTN-AS1-wt和NC+TTN-AS1-mut的細胞的熒光酶素活性分別為(1.00±0.09)、(1.04±0.12)，與miR-3928 mimic+TTN-AS1-mut比較(0.98±0.16)，miR-3928 mimic+TTN-AS1-wt細胞的熒光酶素活性顯著降低(0.34±0.04)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明TTN-AS1直接靶向miR-3928。

2.3miR-3928靶向抑制p38MAPK的表達 miR-3928靶向p38MAPK的結(jié)合位點:MAPK14(位置6589-6595)的堿基序列5′……agccaacuggggagaGAGCUUCu……3′與miR-3928的堿基序列3′-cguccgccuuggaauCUCGAAG-5′具有結(jié)合位點。然后通過雙熒光霉素實驗結(jié)果驗證了同時轉(zhuǎn)染NC+p38MAPK-wt和NC+p38MAPK-mut的細胞的熒光酶素活性分別為(1.00±0.07)、(1.02±0.15)，與miR-3928 mimic+p38MAPK-mut比較(0.95±0.12)，miR-3928 mimic+p38MAPK-wt細胞的熒光酶素活性顯著降低(0.350±0.045)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步研究也發(fā)現(xiàn)，與對照組[分別為(3.36±0.31)、(2.83±0.34)]比較，轉(zhuǎn)染miR-3928mimic后，細胞中p38MAPKmRNA和蛋白的水平降低[分別為(0.83±0.08)、(1.27±0.14)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 TTN-AS1直接靶向miR-3928的結(jié)合位點

2.4各組細胞中TTN-AS1、miR-3928、p38MAPK mRNA和蛋白的水平 mimic組miR-3928水平高于對照組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TTN-AS1組miR-3928水平低于對照組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。mimic+TTN-AS1組miR-3928水平低于mimic組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平高于mimic組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-3928對p38MAPK的抑制作用被TTN-AS1阻斷，見表1。

表1 各組細胞中TTN-AS1、miR-3928、p38MAPK mRNA和蛋白的水平比較

2.5各組細胞的細胞生長和凋亡情況比較 mimic組的細胞活力顯著低于對照組，凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TTN-AS1組的細胞活力高于對照組，細胞凋亡率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且mimic+TTN-AS1組的細胞活力高于mimic組，細胞凋亡率低于mimic組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。過表達TTN-AS1會阻斷miR-3928對細胞生長的抑制作用和對凋亡的促進作用，見表2、圖3。

表2 各組細胞的相對細胞活力和凋亡率比較

2.6各組細胞侵襲能力比較 mimic組的細胞侵襲能力[(20.37±2.08)個]低于對照組[(37.67±3.57)個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TTN-AS1組的細胞侵襲能力[(57.86±3.98)個]高于對照組[(37.67±3.57)個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且mimic+TTN-AS1組的細胞侵襲能力[(39.40±3.14)個]高于mimic組[(20.37±2.08)個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。過表達TTN-AS1會部分逆轉(zhuǎn)miR-3928對細胞侵襲的抑制作用，見圖4。

注：A為對照組、B為mimic組、C為mimic+TTN-AS1組、D為TTN-AS1組。

注：A為對照組、B為mimic組、C為mimic+TTN-AS1組、D為TTN-AS1組。

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)最近的統(tǒng)計報告，2018年宮頸癌新病例數(shù)為569 847例，占所有腫瘤的3.2%。并且2018年死于宮頸癌的患者共有311 365例，占所有惡性腫瘤的3.3%[6]。雖然許多早期診斷宮頸癌的新生物標志物被發(fā)現(xiàn)，并且靶向藥物、免疫療法等新的治療手段被不斷地應(yīng)由于宮頸癌的治療，但由于腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和獲得性耐藥的發(fā)生，仍有一部分患者不能取得較好的預(yù)后[7]。探究宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機制提高是發(fā)展新的診斷和治療策略的基礎(chǔ)。

抑癌基因和促癌基因的異常低表達和過表達是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進展的主要機制，p38MAPK蛋白最初在炎癥和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，后來被認為是一種與腫瘤相關(guān)的蛋白[8]。在宮頸癌中，p38MAPK發(fā)揮促癌作用，激活p38MAPK相關(guān)通路會促進腫瘤細胞遷移和侵襲，是宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機制之一[9]。并且p38MAPK蛋白的表達會受到miRNA的靶向調(diào)節(jié)，miR-374b可通過抑制p38MAPK抑制宮頸癌細胞的增殖并促進凋亡[10]。HE等[11]研究結(jié)果顯示人類早期內(nèi)皮祖細胞增殖能力的升高伴隨著miR-3928水平的降低，提示miR-3928具有抑制細胞增殖的作用。XIA等[12]發(fā)現(xiàn)肺組織中miR-3928的表達水平與肺鱗狀細胞癌患者的惡性表型和不良預(yù)后有關(guān)。并且miR-3928 可具有直接靶向抑制Dicer 蛋白表達的作用[13]。本研究預(yù)測并驗證了miR-3928可直接靶向抑制p38MAPK的表達。

miRNA靶向mRNA的過程受到LncRNA的靶向調(diào)控。LncRNA是一類長鏈RNA，其長度超過200個核苷酸，不具有蛋白質(zhì)翻譯功能。LncRNA可以通過競爭內(nèi)源性RNA的方式作為“海綿”“吸附”miRNA，從而調(diào)節(jié)miRNA在mRNA降解和翻譯中的作用[14]。LncRNA通過靶向miRNA調(diào)節(jié)靶基因表達也是調(diào)節(jié)腫瘤細胞發(fā)生和發(fā)展的機制之一。本研究結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)高水平的TTN-AS1的宮頸癌患者具有更短的無進展生存期，并且TTN-AS1的水平與MAPK14的轉(zhuǎn)錄水平正相關(guān)。并且也進一步驗證了TTN-AS1與miR-3928之間存在靶向關(guān)系。TTN-AS1在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用，包括口腔鱗狀細胞癌、肺腺癌及前列腺癌等[15-17]。本研究結(jié)果顯示過表達TTN-AS1會顯著抑制miR-3928的水平，促進p38MAPK的表達，并阻斷miR-3928對p38MAPK的抑制作用。過表達miR-3928明顯降低了細胞活力和細胞侵襲能力。而TTN-AS1能夠上調(diào)細胞活力和細胞侵襲能力，抑制細胞凋亡。過表達TTN-AS1會顯著阻斷miR-3928對細胞生長、侵襲的抑制作用和對細胞凋亡的促進作用。FU等[18]研究顯示TTN-AS1可通過靶向抑制 miR-134-5p促進MBTD1的表達并抑制骨肉瘤細胞的凋亡和促進耐藥。JIA等[19]發(fā)現(xiàn)TTN-AS1可通過靶向miR-142-5p/CDK5促進肺癌細胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示在宮頸癌中，TTN-AS1通過靶向miR-3928促進細胞生長和侵襲，抑制凋亡。

綜上所述，miR-3928靶向抑制p38MAPK的表達，TTN-AS1可通過直接靶向miR-3928上調(diào)p38MAPK的水平。TTN-AS1通過靶向調(diào)控miR-3928/p38MAPK促進CasKi細胞的增殖和侵襲并抑制凋亡。關(guān)于TTN-AS1和miR-3928在宮頸癌患者中的臨床意義值得進一步研究，關(guān)于TTN-AS1和miR-3928通過p38MAPK調(diào)節(jié)宮頸癌進展的作用尚待進一步的體內(nèi)研究。