MMP伴喘息患兒血清NF-κB、HMGB1表達(dá)與炎性細(xì)胞因子水平的相關(guān)性及其診斷價值*

謝 菲，陳瑞東，趙 潔，徐春艷，岳 彬

滄州市中心醫(yī)院:1.兒內(nèi)一科;2.兒內(nèi)二科,河北滄州 061000

肺炎支原體肺炎(MMP)是兒童常見的呼吸系統(tǒng)感染性疾病，近年來發(fā)病率呈升高趨勢[1]。MMP不僅引起咳嗽、咳痰等癥狀，部分兒童可出現(xiàn)喘息癥狀，嚴(yán)重影響兒童健康和生活質(zhì)量，目前對于MMP伴喘息的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，相關(guān)研究表明，氣道炎性反應(yīng)和免疫紊亂可能是造成喘息發(fā)作的重要基礎(chǔ)[2]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)參與多種炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展，其相關(guān)通路的激活在機(jī)體抗感染性疾病中發(fā)揮重要作用，與機(jī)體抗MMP有密切關(guān)系[3]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種炎癥介質(zhì)，在MMP發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[4]。NF-κB和HMGB1及其相關(guān)炎性因子可能與MMP伴喘息的發(fā)生密切相關(guān)。本研究分析血清NF-κB、HMGB1表達(dá)水平與MMP伴喘息患兒炎性細(xì)胞因子的關(guān)系及其診斷價值，旨在初步探究NF-κB、HMGB1對MMP伴喘息的可能作用機(jī)制及兩者的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年10月本院收治的MMP患兒90例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患兒均符合MMP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。①患兒發(fā)熱，表現(xiàn)為弛張熱或不規(guī)則熱，咳嗽重；②雙肺呼吸音粗、干啰音或濕羅音；③胸片可見大葉性肺炎、間質(zhì)性肺炎、支氣管肺炎或肺門淋巴結(jié)腫大；④血MMP-IgG或MMP-IgM≥1∶160。(2)患兒年齡1～8歲，入院時病程<2周。(3)入院前6個月內(nèi)未服用抗感染及影響免疫功能的藥物。(4)患兒家屬對研究知情同意且簽署知情同意協(xié)議。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有支氣管哮喘、慢性呼吸系統(tǒng)疾病的患兒。(2)患有先天性免疫疾病的患兒。(3)合并其他部位感染和炎癥的患兒。(4)不能完成研究的患兒。根據(jù)是否伴有喘息分為MMP伴喘息組38例和MMP不伴喘息組52例。另選取同期健康兒童40例作為健康對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡1～9歲；(2)家屬對研究知情同意，能完成研究。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號[(倫審)H20171109]。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集 所有患兒于入院當(dāng)日采集外周靜脈血5 mL，健康對照組兒童采集外周靜脈血5 mL，均用兩個試管分裝，靜置后經(jīng)4 000 r/min離心5 min，離心半徑12 cm，分離血清用于熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測。

1.2.2熒光定量PCR檢測NF-κB、HMGB1表達(dá)水平 取一試管血清，應(yīng)用Trizol-氯仿-異丙醇-乙醇法提取血清中總RNA，并按照試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，試劑盒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參引物，內(nèi)參采用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，以上引物由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)完成，引物序列見表1。應(yīng)用熒光定量PCR檢測各組血清NF-κB、HMGB1表達(dá)水平，儀器為瑞士Roche公司生產(chǎn)的Cobas 480熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；60 ℃，35 s，共40個循環(huán)，經(jīng)過40個循環(huán)擴(kuò)增后收集熒光信號，根據(jù)目的因子、內(nèi)參GAPDH的循環(huán)閾值(Ct)，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量：ΔCt=Ct(目的因子)-Ct(GAPDH)；ΔΔCt=ΔCt-ΔCt(對照樣本)，每個樣本設(shè)計(jì)3個復(fù)孔，取3個復(fù)孔的平均值作為相對表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測炎性細(xì)胞因子水平 取另一試管血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，試劑盒為上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組兒童基線資料比較 90例MMP患兒中，MMP伴喘息組患兒38例，男性21例、女性17例，平均(5.38±2.04)歲，平均病程(5.92±2.12)d；MMP不伴喘息組患兒52例，男性29例、女性23例，平均(5.42±2.11)歲，平均病程(5.34±2.15)d ；健康對照組，男性22例、女性18例，平均(5.32±2.27)歲，各組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MMP伴喘息組與MMP不伴喘息組性別、年齡、病程比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2各組血清NF-κB及HMGB1表達(dá)水平比較 MMP伴喘息組、MMP不伴喘息組患兒血清NF-κB及HMGB1表達(dá)水平高于健康對照組，MMP伴喘息組患兒血清NF-κB及HMGB1表達(dá)水平高于MMP不伴喘息組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組血清NF-κB及HMGB1表達(dá)水平比較

2.3各組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 MMP伴喘息組、MMP不伴喘息組患兒血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平高于健康對照組，MMP伴喘息組患兒血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平高于MMP不伴喘息組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較

2.4MMP伴喘息患兒血清NF-κB及HMGB1表達(dá)水平與血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，MMP伴喘息患兒血清NF-κB表達(dá)水平與血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.001)，血清HMGB1表達(dá)水平與血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.001)，見表4。

表4 MMP伴喘息患兒血清NF-κB及HMGB1表達(dá)水平與血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平的相關(guān)性分析

2.5血清NF-κB、HMGB1、IL-1β、IL-6及TNF-α水平對MMP伴喘息患兒診斷的ROC曲線分析 繪制ROC曲線分析血清NF-κB、HMGB1、IL-1β、IL-6及TNF-α對MMP伴喘息的診斷價值，結(jié)果顯示血清NF-κB最佳臨界值為4.78，其靈敏度為88.28%，特異度為87.38%，ROC曲線下面積(AUC) 為0.863，95%CI為0.752～0.895；血清HMGB1最佳臨界值為3.67，其靈敏度為84.74%，特異度為80.43%，AUC為0.815，95%CI為0.746～0.895；血清IL-1β最佳臨界值為19.53 ng/mL，其靈敏度為70.24%，特異度為64.55%，AUC為0.685，95%CI為0.621～0.732；血清IL-6最佳臨界值為16.24 ng/mL，其靈敏度為73.47%，特異度為66.89%，AUC為0.703，95%CI為0.637～0.754；血清TNF-α最佳臨界值為42.87 ng/mL，其靈敏度為65.54%，特異度為58.23%，AUC為0.635，95%CI為0.596～0.685，血清NF-κB、HMGB1對MMP伴喘息的診斷價值優(yōu)于血清IL-1β、IL-6及TNF-α，見圖1。

圖1 血清NF-κB、HMGB1、IL-1β、IL-6及TNF-α水平對MMP伴喘息患兒診斷的ROC曲線分析

3 討 論

MMP是一種好發(fā)于學(xué)齡前兒童的呼吸系統(tǒng)感染性疾病，近年來發(fā)病率居高不下，有報道顯示，在冬春季等高發(fā)季節(jié)，MMP占兒童下呼吸道感染的30%[6]。與普通肺炎不同，MMP可引起胸腔積液、壞死性肺炎、肺不張等，另外約有25%的MMP患兒可出現(xiàn)血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)并發(fā)癥[7-8]。尤其是部分患兒可發(fā)生喘息，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量。目前對于MMP患兒發(fā)生喘息的機(jī)制仍未完全明確，研究表明其機(jī)制可能與以下幾方面有關(guān)：(1)肺炎支原體直接造成呼吸道上皮損傷，增加呼吸道的反應(yīng)性[9]；(2)肺炎支原體細(xì)胞膜中含有豐富的脂質(zhì)相關(guān)蛋白，進(jìn)入體內(nèi)后促進(jìn)炎性因子的釋放，引起喘息[10]；(3)肺炎支原體感染后激活體內(nèi)免疫細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能失調(diào)，誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生[11]。

NF-κB是一類可以參與多種炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展的蛋白質(zhì)，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，正常情況下僅少量分泌入血液，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)時，可以刺激細(xì)胞核合成NF-κB，并釋放入血[12]。有研究表明，NF-κB可以選擇性結(jié)合B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體多個信號通路[13]。另外當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)時，NF-κB可以與TNF受體相關(guān)因子1結(jié)合，引起機(jī)體TNF-α水平升高，NF-κB還可以通過與白細(xì)胞表面Toll樣受體結(jié)合，導(dǎo)致IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子表達(dá)升高，引起級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[14-16]。HMGB1主要存在于細(xì)胞核當(dāng)中，是一種廣泛分布的非組蛋白[17]，XUE 等[18]發(fā)現(xiàn)，HMGB1是一種重要的晚期致炎因子，其生成受多種炎性細(xì)胞因子的調(diào)控，當(dāng)HMGB1釋放到細(xì)胞外，可激活HMGB1/NF-κB通路，從而引發(fā)炎性反應(yīng)。劉麗芬[19]報道指出，HMGB1、TNF-α、C-反應(yīng)蛋白在支氣管哮喘急性發(fā)作中起重要作用。

本研究采用熒光定量PCR檢測MMP伴喘息、MMP不伴喘息和健康兒童血清中NF-κB及HMGB1表達(dá)水平，結(jié)果顯示，MMP伴喘息組患兒血清NF-κB及HMGB1表達(dá)水平高于MMP不伴喘息組和健康對照組，提示在MMP喘息發(fā)生中NF-κB及HMGB1起重要作用。分析原因可能為MMP伴喘息患兒存在呼吸道高反應(yīng)性、免疫功能失調(diào)及呼吸道的慢性炎癥，這部分患兒感染肺炎支原體后，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生NF-κB，并調(diào)節(jié)機(jī)體多個信號通路，引起級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[20]；MMP伴喘息患兒HMGB1也大量釋放到細(xì)胞外，引發(fā)炎性反應(yīng)[21]。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，MMP伴喘息組患兒血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平高于MMP不伴喘息組和健康對照組兒童，提示IL-1β、IL-6及TNF-α促進(jìn)MMP喘息的發(fā)生。IL-1β主要由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，具有誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答、刺激T細(xì)胞活化、促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體的作用[22]。IL-6則具有活化T細(xì)胞、刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生、增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞功能的作用[23]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫功能失調(diào)時，可以出現(xiàn)IL-1β、IL-6水平升高。TNF-α是機(jī)體重要的炎性細(xì)胞因子，適當(dāng)?shù)腡NF-α可以對機(jī)體起到保護(hù)作用，但當(dāng)TNF-α產(chǎn)生過多時可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和B淋巴細(xì)胞增殖，導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答增強(qiáng)[24]。筆者推測，MMP伴喘息患兒存在免疫功能失調(diào)和炎性反應(yīng)，因此血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平升高。

經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，MMP伴喘息患兒血清NF-κB與IL-1β、IL-6及TNF-α水平呈正相關(guān)，血清HMGB1與IL-1β、IL-6及TNF-α水平呈正相關(guān)，說明各指標(biāo)可能參與了MMP伴喘息的發(fā)展過程，與陳敏等[25]報道結(jié)果相符，推測當(dāng)MMP患兒發(fā)生喘息后HMGB1可促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生IL-1β、IL-6及TNF-α，進(jìn)而促進(jìn)疾病發(fā)展。本研究還分析了血清NF-κB及HMGB1對MMP伴喘息患兒的診斷價值，結(jié)果顯示血清NF-κB診斷MMP伴喘息的靈敏度為88.28%，特異度為87.38%，血清HMGB1診斷MMP伴喘息的靈敏度為84.74%，特異度為80.43%，血清NF-κB、HMGB1對MMP伴喘息的診斷價值優(yōu)于血清IL-1β、IL-6及TNF-α，提示對疑似MMP患兒進(jìn)行血清NF-κB及HMGB1檢測可以為MMP伴喘息的診斷提供輔助依據(jù)。

綜上所述，MMP伴喘息患兒血清NF-κB、HMGB1表達(dá)水平、IL-1β、IL-6及TNF-α水平異常升高，患兒血清NF-κB、HMGB1與IL-1β、IL-6及TNF-α呈正相關(guān)。血清NF-κB、HMGB1的檢測對MMP伴喘息具有較好的診斷價值。由于本研究開展時間尚短，收集的病例樣本量較少，因此未進(jìn)一步對不同病情程度的患兒進(jìn)行分組且未對入組患兒進(jìn)行隨訪，以探究血清NF-κB、HMGB1與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系，后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量并增加隨訪以期獲取更加全面的結(jié)論。