PDGF-B和PDGFR-β蛋白在狼瘡性腎炎中的表達(dá)及臨床意義*

張銘明，張 銳，楊小珂，帥宗文

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，安徽合肥 230022

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種與自身免疫介導(dǎo)的免疫性炎性反應(yīng)為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，病程遷延反復(fù)，以產(chǎn)生許多自身抗體及大量免疫復(fù)合物沉積為特征的自身免疫性疾病[1]。狼瘡性腎炎(LN)是SLE最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[2]，目前對其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)主要是通過腎臟組織活檢病理檢查，尋找一些簡單的、特異性的標(biāo)志物是其研究的熱點。血小板衍生生長因子(PDGF)-B 是來源于人血小板的一種重要的促血管生成因子,它與其受體結(jié)合后，可以通過激活與細(xì)胞增殖有關(guān)的酶來調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分解，從而減少癌細(xì)胞表面黏附分子，促進腫瘤的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)病機制中被廣泛研究[3-4]。有研究表明，PDGF-B和β型血小板衍生生長因子受體(PDGFR-β)蛋白通過多種信號通路介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、炎性細(xì)胞浸潤等病理生理過程參與腎纖維化形成[5-6]。本研究旨在進一步探討這些蛋白在LN患者腎臟和外周血中的表達(dá)及臨床意義?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年10月至2019年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院 SLE患者64例為研究對象，男性7例、女性57例，年齡為19～68 歲，平均(38.8±12.0)歲。SLE患者根據(jù)文獻[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)分為LN組34例、SLE非LN組30例，LN 的納入標(biāo)準(zhǔn)為至少符合以下3個條件中的1條:(1)24 h 尿蛋白定量(24 h UPQ)≥0.5 g，或連續(xù)兩次蛋白尿≥3+；(2)存在紅細(xì)胞管型、顆粒管型等各種疾病的管型尿；(3)腎損傷，腎功能異常。排除標(biāo)準(zhǔn)為各種原發(fā)性、繼發(fā)性腎臟疾病。另選取本院健康體檢中心體檢健康者28例作為對照組，男性6例、女性22例，年齡22～67歲，且無自身免疫性疾病家族史。本研究獲得本院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 免疫組織化學(xué)染色PDGF-B和PDGFR-β抗體來自于Sinobiologic公司，血清PDGF-B和PDGFR-β酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒來自于eBioscience 公司，抗 C1q 抗體ELISA檢測試劑盒來自于德國Orgentec診斷公司，抗 ds-DNA抗體試劑盒由上?？菩律锕咎峁?。洗板機為深圳雷杜公司RaytoRT3100，酶標(biāo)儀為奧地利 TECAN 公司TECAN sunrise，生化分析儀為羅氏COBAS C 701全自動分析儀。

1.3標(biāo)本的采集與檢測 SLE腎臟組織標(biāo)本來源于腎臟穿刺，免疫組化染色采用二步法，染色步驟按常規(guī)操作，腎臟組織切片進行常規(guī)脫蠟、水化，3%過氧化氫(H2O2) 室溫孵育 10 min 去除內(nèi)源性過氧化物酶，分別加入PDGF-B抗體(1∶100)和PDGFR-β抗體(1∶100)，陰性對照采用兔IgG作為一抗，陽性對照采用試劑公司提供的陽性對照片。結(jié)果按照試劑說明書指示以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)顆粒狀黃色物質(zhì)為陽性反應(yīng)。采用陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率評分和染色強度評分來綜合評判。判定標(biāo)準(zhǔn):染色強度(無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色和2分，棕褐色為3分)；陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～<25%為1分，25%～<75%為2 分，≥75%為3分。染色強度和陽性細(xì)胞比例得分之和為最終結(jié)果來統(tǒng)計陽性表達(dá)率，分?jǐn)?shù)≥3 分為陽性表達(dá)；組織染色讀片由兩位病理醫(yī)師在雙盲的情況下進行，取平均值。SLE患者及對照組血清標(biāo)本經(jīng)3 500 r/min 離心 5 min，分離后-20 ℃保存。PDGF-B和PDGFR-β蛋白及抗 C1q 抗體、抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體按照說明書進行ELISA檢測。補體 C3、C4、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、24 h UPQ、估算腎小球濾過率(eGFR1)采用羅氏COBAS C 701全自動生化分析儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1各組腎臟組織中PDGF-B和PDGFR-β蛋白陽性表達(dá)率比較 LN組腎臟組織中PDGF-B和PDGFR-β蛋白陽性表達(dá)率分別為79.41%和76.47%，明顯高于SLE非LN組(分別為36.67%和33.33%)和對照組(分別為6.66%和0.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SLE非LN組腎臟組織中PDGF-B和PDGFR-β蛋白陽性表達(dá)率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2各組外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平比較 LN組、SLE非LN組外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LN組PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平與SLE非 LN 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

注：A和B分別為PDGF-B和PDGFR-β蛋白在對照組腎臟組織中的表達(dá)；C和D分別為PDGF-B和PDGFR-β蛋白在SLE非LN組腎臟組織中的表達(dá)；E和F分別為PDGF-B和PDGFR-β蛋白在LN組腎臟組織中的表達(dá)。

表1 各組外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平比較

2.3LN患者PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 LN患者腎臟組織中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平與抗 C1q 抗體呈正相關(guān)(P<0.05)，與eGFR1呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與C3、C4、hs-CRP、Cr、BUN、SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)評分、抗ds-DNA抗體、24 h UPQ無相關(guān)性(P>0.05)；外周血中PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平與SLEDAI評分、抗 ds-DNA抗體、24 h UPQ、抗 C1q 抗體呈正相關(guān)(P<0.05)，與補體C3、eGFR1呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與C4、hs-CRP、Cr、BUN無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 LN患者PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4LN患者腎臟組織和外周血PDGF-B與PDGFR-β蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析 LN患者腎臟組織和外周血中PDGF-B與PDGFR-β蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)(腎臟組織r=0.663,P<0.001；外周血r=0.547,P=0.001)。

3 討 論

LN是SLE最常見的并發(fā)癥之一，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，進展迅速，大部分LN患者會進展為終末期腎病，而腎臟纖維化是LN腎臟病變進展至終末期腎病的共同通路[7]。近年來，大量臨床和實驗研究表明，腎小管間質(zhì)纖維化程度是反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)，LN腎損傷程度與有無腎小管間質(zhì)炎癥、腎臟纖維化密切相關(guān)，LN活動性增加可加速其纖維化進程[8]，因此，對LN患者中某些炎癥因子及特異性蛋白表達(dá)的研究具有重要臨床意義。

PDGF-B和PDGFR-β蛋白作為間充質(zhì)細(xì)胞的有效促有絲分裂劑在細(xì)胞的遷移和增殖過程中具有重要的生物學(xué)作用。機體內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積與其過表達(dá)密切相關(guān)，PDGF-B和PDGFR-β蛋白不僅可以通過介導(dǎo)炎癥因子的釋放在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而且還是間充質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等)遷移和增殖的有效激活劑，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究表明[9]，PDGF-B可以通過PDGFR-β蛋白啟動與腎纖維化相關(guān)的多條信號通路，其中與致纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的協(xié)同作用信號通路在促進腎纖維化的進展中具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-B和PDGFR-β蛋白在對照組腎臟組織中很少或無表達(dá)，在SLE非LN組中表達(dá)不高，而在LN組中高表達(dá)，在LN患者腎小球、球旁器、腎小管間質(zhì)中均有表達(dá)，尤其在腎系膜細(xì)胞,間質(zhì)成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)較高。在LN組外周血PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)水平也明顯高于SLE非LN組及對照組，結(jié)果表明PDGF-B和PDGFR-β蛋白對LN的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，其表達(dá)增多是多種通路共同作用的結(jié)果，在炎癥細(xì)胞、免疫復(fù)合物損傷、治療藥物等作用下，腎間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞等PDGF-B和PDGFR-β蛋白表達(dá)上調(diào)，PDGF-B和PDGFR-β蛋白的表達(dá)上調(diào)既可通過多種通路促進細(xì)胞生長、分化及遷移，又可介導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)、生長、分化及增殖等生理過程，導(dǎo)致腎小球硬化和小管間質(zhì)的纖維化。有研究表明，PDGF mRNA在健康者中表達(dá)很低，而在系膜增生性腎小球腎炎中，PDGF mRNA和受體的表達(dá)均明顯升高，腎小球的損傷程度和PDGF mRNA陽性細(xì)胞數(shù)的增多具有明顯相關(guān)性，增殖性腎炎PDGFR的過度表達(dá)與細(xì)胞增殖程度、損傷狀態(tài)、疾病活動狀態(tài)呈正相關(guān)，而PDGF-B的特異性抑制劑可明顯減少腎小球內(nèi)細(xì)胞的增生和炎性細(xì)胞的浸潤[5,10]。本研究也發(fā)現(xiàn)在LN腎臟組織和外周血中PDGF-B蛋白與其受體PDGFR-β蛋白呈正相關(guān)，進一步說明PDGF-B蛋白與其受體PDGFR-β蛋白在LN 腎臟組織細(xì)胞增生及纖維化中發(fā)揮重要作用。PDGF-B蛋白與其受體之間親和度高，PDGF信號通路的傳導(dǎo)可能通過刺激其受體開始，再通過磷酸化、激酶活化等一系列途徑介導(dǎo)，受體PDGFR-β蛋白的活動狀態(tài)與刺激的信號強度及磷酸化的程度具有一定的相關(guān)性。

LN腎臟組織的免疫損傷主要由大量自身抗原抗體復(fù)合物沉積于腎小球和腎小管間質(zhì)造成，在臨床檢測指標(biāo)中，特異性自身抗體及補體 C3、C4、Cr、BUN、hs-CRP、24 h UPQ、eGFR1等與其病情活動性及嚴(yán)重程度密切相關(guān)[11]，本研究發(fā)現(xiàn)，在LN腎臟組織中PDGF-B蛋白與其受體PDGFR-β蛋白僅與eGFR1、抗 C1q 抗體呈正相關(guān)，而外周血中其表達(dá)水平與SLEDAI評分、抗 ds-DNA抗體、hs-CRP、24 h UPQ、eGFR1、抗 C1q 抗體均呈正相關(guān)，可能是由于LN腎臟組織免疫病理的改變與外周血中臨床指標(biāo)改變有不同步的發(fā)展，外周血炎癥指標(biāo)的發(fā)展滯后于腎臟組織病理的發(fā)展，eGFR1是腎損傷最直接的評價指標(biāo)，它的變化趨勢直接體現(xiàn)腎臟的損傷程度，抗 C1q 抗體可以通過促進細(xì)胞凋亡、抑制凋亡細(xì)胞清除，致使大量蛋白產(chǎn)物在腎臟沉積，腎小球補體 C1q 沉積的強度與免疫球蛋白 IgG 復(fù)合物量的多少及沉積部位相關(guān)，這可能是導(dǎo)致其與腎臟組織PDGF-B、PDGFR-β蛋白直接相關(guān)的原因。本研究也發(fā)現(xiàn)LN外周血中PDGF-B、PDGFR-β蛋白與炎癥指標(biāo)及特異性自身抗體密切相關(guān)，說明PDGF-B大量分泌后，PDGF-B 除了自身具有促纖維化功能外，還能夠通過其他通路，誘導(dǎo)炎癥因子釋放及自身抗體的產(chǎn)生，從而加速細(xì)胞外基質(zhì)的聚集和細(xì)胞的纖維化進程。在LN患者中誘發(fā)炎癥后，DNA片段可能過度激活，通過TLR9/TGF-β1/PDGF-B 通路產(chǎn)生大量的PDGF-B，TGF-β1可以誘導(dǎo)腎纖維化，而PDGF-B可以進一步刺激系膜細(xì)胞的增生[9]。

有研究表明[12]，通過阻止PDGF-B激活途徑可以有效改善腎小球腎炎等腎臟疾病和LN。在體外研究中[13],PDGF-B和PDGFR-β siRNAs基因的沉默可以減少系膜細(xì)胞增殖和遷移，采用TGF-β1/PDGF-B拮抗劑可以阻止腎纖維化和腎衰竭。對SLE 患者進行免疫抑制劑治療后，其SLEDAI評分明顯降低，伴隨TGF-β1/PDGF-B蛋白表達(dá)水平下降,因此，PDGF-B/PDGFR-β 信號通路抑制劑的研究為LN患者腎纖維化的治療提供了新的措施[12,14]。

PDGF-B和PDGFR-β蛋白參與了 SLE 腎損傷的發(fā)病機制，對LN的判斷具有重要臨床價值。