急性肺損傷患者血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平及與預(yù)后相關(guān)性分析*

曾宗鼎，邢崇浩，鄭輝才，卓 越，李 鎮(zhèn)，杜 莉，陳 亮，張璐璐

三亞中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南三亞 572000

急性肺損傷(ALI)是一種氣道及肺實(shí)質(zhì)內(nèi)急性炎性反應(yīng)的重癥呼吸系統(tǒng)疾病，其起病急驟，病情進(jìn)展迅速，病死率極高，對患者生命健康造成極大的威脅[1]。微小核糖核酸(miRNA)作為一類新型的基因調(diào)控分子，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等過程，可通過影響靶基因的表達(dá)而調(diào)控炎癥通路和免疫反應(yīng)，在ALI發(fā)病過程中起重要作用[2-3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-221及miR-300在ALI中發(fā)生差異表達(dá)，有望成為治療ALI的潛在靶點(diǎn)[4-5]。本研究通過檢測ALI患者血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平，探討血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平與ALI患者預(yù)后的關(guān)系，旨在為ALI的診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年6月三亞中心醫(yī)院收治的ALI患者137例，男性87例、女性50例，年齡31～83歲，平均(56.82±10.24)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制訂的ALl診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并結(jié)合臨床癥狀及體征確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷不明確者，合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及其他呼吸系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2研究方法 收集ALI患者一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、病因、心率、呼吸頻率、平均動脈壓、呼氣末正壓、動脈二氧化碳分壓及動脈血氧分壓等。以ALI患者發(fā)病當(dāng)天為研究起點(diǎn)，ALI患者痊愈出院或死亡作為研究終點(diǎn)，將其分為存活組(90例)和死亡組(47例)。對所有ALI患者采用急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評分系統(tǒng)軟件計(jì)算APACHEⅡ評分值，APACHEⅡ評分>20分為高危組(63例)，APACHEⅡ評分≤20分為低中危組(74例)。

1.3miR-221及miR-300檢測 所有ALI患者均于發(fā)病當(dāng)天采集空腹靜脈血5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA) 抗凝管中，離心分離血漿。采用ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μL 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μL逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μL)，1.50 μL 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μL RNase抑制劑(20 U/μL)，4.16 μL無菌三蒸水；反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5min。PCR總反應(yīng)體系為20 μL:1 μL引物及探針Mix(20×)，10 μL TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μL無核酸酶的水；擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值的經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-221及miR-300的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1死亡組和存活組一般資料比較 死亡組平均動脈壓、呼氣末正壓及APACHEⅡ評分與存活組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、病因、呼吸頻率、心率、動脈血氧分壓及動脈二氧化碳分壓比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 死亡組和存活組一般資料比較

2.2死亡組和存活組血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平比較 死亡組血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平均明顯高于存活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 死亡組和存活組血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平比較

2.3高危組和低中危組血漿miR-221、miR-300表達(dá)水平及病死率比較 高危組血漿miR-221、miR-300表達(dá)水平及病死率均明顯高于低中危組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4多因素Logistic回歸分析ALI患者死亡的危險(xiǎn)因素 以ALI患者是否發(fā)生死亡為因變量(死亡組：Y=1，存活組：Y=0)，將存活組和死亡組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目：平均動脈壓、呼氣末正壓、APACHEⅡ評分、血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)APACHEⅡ評分、血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平升高是ALI患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其OR(95%CI)值分別為2.490(1.583～4.206)、3.270(2.247～7.115)、2.683(1.715～6.207)。見表4。

2.5血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平預(yù)測ALI患者死亡的價(jià)值 血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平預(yù)測ALI患者死亡的最佳截?cái)嘀捣謩e為2.80、1.73。miR-221及miR-300二者聯(lián)合預(yù)測ALI患者死亡的AUC明顯高于單項(xiàng)miR-221、miR-300，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.426、4.705，P<0.05)，其靈敏度和特異度為92.0%和84.2%。見圖1和表5。

表3 高危組和低中危組血漿miR-221、miR-300表達(dá)水平及病死率比較

圖1 血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平預(yù)測ALI患者死亡的ROC曲線

表4 多因素Logistic回歸分析ALI患者死亡的危險(xiǎn)因素

續(xù)表4 多因素Logistic回歸分析ALI患者死亡的危險(xiǎn)因素

表5 血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平預(yù)測ALI患者死亡的價(jià)值

3 討 論

ALI是一種病死率高、嚴(yán)重危害人類健康的疾病。如何早期預(yù)測ALI患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后，進(jìn)而針對其進(jìn)行個(gè)體化治療，對提高臨床預(yù)后及降低病死率具有重要意義。ZHENG等[7]研究表明，miRNA參與了ALI的發(fā)生、發(fā)展，在ALI炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)控作用，將有望成為ALI的新型生物標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。

本研究中死亡組血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平均明顯高于存活組，高危組血漿miR-221、miR-300表達(dá)水平及病死率均明顯高于低中危組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平升高與ALI患者的病情嚴(yán)重程度有關(guān)，血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平高的ALI患者預(yù)后較差，發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)較高。WANG等[8]研究表明，ALI肺組織miR-221表達(dá)水平顯著升高，miR-221的上調(diào)則加重了脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥，在ALI炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。CAO等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在ALI患者miRNA表達(dá)水平明顯升高，且miRNA表達(dá)水平變化與ALI患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)。

本研究應(yīng)用多因素Logistic回歸分析，APACHEⅡ評分、血漿miR-221及miR-300水平升高是ALI患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CHHANGANI等[10]研究顯示，隨著APACHEⅡ評分分值增高，重癥患者醫(yī)院感染率、住院病死率均明顯升高，APACHEⅡ評分對預(yù)測重癥患者的預(yù)后有一定的應(yīng)用價(jià)值。本研究ROC曲線顯示，miR-221及miR-300二者聯(lián)合預(yù)測ALI患者死亡的AUC最大，其靈敏度和特異度較高。說明miR-221及miR-300二者聯(lián)合檢測有助于提高預(yù)測ALI患者死亡的價(jià)值。ZHAO等[11]研究指出，miR-221的表達(dá)增強(qiáng)了脂多糖刺激下促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可加重急性肺損傷和炎性反應(yīng)，提示miR-221的異常表達(dá)參與炎癥性肺疾病的發(fā)生發(fā)展。FERRUELO等[12]研究認(rèn)為，miRNA是一類新的基因表達(dá)途徑，在炎癥或凋亡中發(fā)揮重要作用，可作為ALI診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物。LU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與ALI的疾病發(fā)展和疾病嚴(yán)重性有關(guān)，可作為ALI預(yù)后評估的生物標(biāo)志物，同時(shí)也為臨床治療ALI提供新的思路。但本研究為單中心的小樣本研究，其結(jié)論可能存在一定的片面性和局限性，今后仍需更多的臨床研究來證實(shí)。

血漿miR-221及miR-300表達(dá)水平升高與ALI患者預(yù)后不良相關(guān)，是ALI患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有望作為預(yù)測ALI患者預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。