先天性膽管擴張癥患者轉(zhuǎn)化生長因子β1、白細胞介素-32的表達水平及臨床相關(guān)性分析*

吳宙光,王 斌,程 珍,張文杰,鄭佳辰,李一帆

深圳市兒童醫(yī)院普外二區(qū)，廣東深圳 518026

先天性膽管擴張癥(CBD)是一種良性的先天性膽道異常，以肝外和/或肝內(nèi)膽管的囊性擴張為特征，該病通常發(fā)生在兒童時期，CBD常與胰膽交界處相關(guān)，并可與復(fù)發(fā)性膽管炎、肝硬化、膽總管結(jié)石、胰腺炎、膽管癌等長期并發(fā)癥相關(guān)，表現(xiàn)為腹痛、嘔吐和黃疸，大多數(shù)輕微兒童膽管炎患者可以保守治療，而一些患有嚴重膽管炎的兒童需要膽汁引流，炎癥得到控制后，行擴張膽管切除和肝管空腸吻合術(shù)[1-2]。但術(shù)前或術(shù)后常引起各類并發(fā)癥導(dǎo)致病情遷移，而尋找有效的治療靶點對疾病的診斷及治療十分重要。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)屬于轉(zhuǎn)化生長因子家族的組成部分，主要介導(dǎo)細胞的生長、增殖和損傷修復(fù)[2]。白細胞介素-32(IL-32)主要由病原體和促炎細胞因子誘導(dǎo)，在免疫細胞中發(fā)揮重要作用，IL-32作為細胞因子是細胞信號通路的重要組成部分，參與細胞生長、代謝、激素信號、免疫等多種生理功能的調(diào)節(jié)。早期研究表明IL-32調(diào)節(jié)細胞生長、代謝和免疫，參與肝膽等免疫炎癥性疾病的病理調(diào)節(jié)或作為保護劑[3-5]。本研究擬通過探討CBD患兒中IL-32和TGF-β1的表達水平及其與臨床指標的相關(guān)性研究，為進一步早期識別和治療該類疾病提供堅實的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年12月至2019年12月本院兒科住院收治的CBD患兒72例為研究組，其中男42例、女30例，年齡為9個月至14歲，平均(7.2±3.6)歲，另選取同期肝移植供體肝膽管組織正常的40例患者作為對照組，男26例、女14例，年齡為8個月至13歲，平均(7.0±3.8)歲，兩組年齡、性別、體質(zhì)量、手術(shù)時間、出血量等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有研究組均行手術(shù)根治性治療，其中有2例急性梗阻性化膿性膽囊炎患兒進行膽總管造瘺術(shù)引流后再行手術(shù)治療。兩組研究對象知情并簽署知情同意書。

1.2TGF-β1、IL-32水平及病理組織檢測 所有研究對象采集空腹靜脈血液5～10 mL，1 000 r/min室溫下離心后取上清液，-80 ℃保存。獲取研究組的肝組織和膽管組織標本，4%多聚甲醛固定后，于4 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法對所有研究對象的血清TGF-β1、IL-32水平進行檢測，嚴格按照試劑盒步驟進行操作(武漢默沙克生物科技有限公司)。使用熒光定量PCR法檢測肝組織TGF-β1、IL-32的mRNA相對表達水平，用Trizol法提取肝組織中RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)配合相應(yīng)體系在CFX96Touch熒光定量PCR儀上機反應(yīng)(美國伯樂公司)，TGF-β1、IL-32的mRNA相對表達水平檢測是基于基因表達閾值(Ct)的方法，即mRNA(2-ΔΔCt)進行計算，樣本間重復(fù)3次。將患兒膽管組織標本進行常規(guī)病理檢測[2]，根據(jù)不同病理程度(HE染色)可分為黏膜上皮細胞脫落(中度、重度)、肉芽組織增生(中度、重度)、管壁增生肥厚(中度、重度)、炎癥細胞浸潤(中等、大量)。免疫組化檢測包括石蠟切片、脫蠟、封閉、修復(fù)抗原，采用相應(yīng)的TGF-β1、IL-32抗體(上海賽默飛Invitrogen公司)進行檢測，計算相應(yīng)陽性細胞百分比。測定結(jié)果判讀：在高倍鏡下采用病理圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進行判定，膽囊壁、膽管壁切片中出現(xiàn)棕褐色或棕黃物為相應(yīng)的TGF-β1及IL-32抗體陽性，不顯色則為陰性。

1.3觀察指標 兩組研究對象的血清TGF-β1、IL-32水平及其肝組織中mRNA相對表達水平進行比較，分析CBD患兒肝功能指標[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、血清總膽汁酸(TBA)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)]與血清TGF-β1、IL-32的相關(guān)性,以及CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1和IL-32表達情況。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清TGF-β1和IL-32水平及其肝組織中mRNA相對表達水平比較 研究組血清TGF-β1和IL-32水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。熒光定量PCR顯示，研究組肝組織中TGF-β1和IL-32 的mRNA相對表達水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2CBD患兒肝功能指標與血清TGF-β1、IL-32的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，CBD患兒的血清TGF-β1、IL-32與ALT、AST及γ-GGT水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表1 兩組血清TGF-β1和IL-32水平比較

圖1 兩組肝組織中TGF-β1和IL-32 的mRNA相對表達水平比較

表2 CBD患兒肝功能指標與血清TGF-β1、IL-32的相關(guān)性

2.3CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1和IL-32的表達情況 CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1、IL-32表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1和IL-32表達情況[n(%)]

3 討 論

CBD是兒童高發(fā)性的膽道畸形疾病，目前發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病機制尚不清楚，主要機制是膽管與胰管在十二指腸壁外合流的先天性畸形的解剖學因素，由于十二指腸乳頭括約肌無法控制住合流部引起膽汁與胰液的逆流，導(dǎo)致膽道及胰腺相關(guān)性病理改變[6-8]。主要臨床癥狀包括腹部上區(qū)包塊、腹痛和黃疸，常合并膽囊炎、膽結(jié)石、膽道狹窄等癥狀，通常采用手術(shù)治療，但存在多種并發(fā)癥可能，甚至癌變[2,7]。因此，尋找潛在血清學生物標志物，對于疾病的診斷和防治十分重要。

TGF-β1是具有多種生物功能的細胞因子，在細胞的增殖、分化、瘢痕形成及免疫調(diào)節(jié)等方面至關(guān)重要，機體出現(xiàn)損傷后，TGF-β1在肌成纖維細胞中表達升高，而TGF-β1水平的升高又能促進細胞的增殖和分化，利于組織的損傷修復(fù)[9]。TGF-β1可誘導(dǎo)其他生長因子的生長促進膠原蛋白的合成，刺激纖維素生成，增強細胞與基質(zhì)間的相互作用，同時能夠減少細胞間基質(zhì)蛋白的合成，下調(diào)金屬蛋白酶的活性，促進組織生理修復(fù)，觸發(fā)對組織的纖維化修復(fù)作用[10]。TGF-β1也可通過抑制過度的炎癥，調(diào)節(jié)免疫炎癥本身是組織修復(fù)的一個重要決定因素[11]。另外，TGF-β1還是誘導(dǎo)肝纖維化最重要的細胞因子，該細胞因子可通過TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路直接激活肝衛(wèi)星細胞，導(dǎo)致肝纖維化形成[12]。研究表明，TGF-β1在膽汁淤積性肝硬化、肝內(nèi)膽管結(jié)石合并膽管狹窄患者中表達升高主要促進其向膽管細胞增殖分化[9,13]。本研究提示TGF-β1在CBD的表達上調(diào)，可促進膽道的纖維化增生[2]。近期病理組織免疫組化研究表明TGF-β1在CBD的膽管壁明顯高于膽囊壁，說明膽管壁的損傷在CBD患者中更為敏感[2]，但本研究尚未進行相關(guān)的亞組分析，今后需擴大樣本和分組分析進一步證實。本研究還發(fā)現(xiàn)，研究組肝組織中TGF-β1和IL-32 的mRNA相對表達水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1、IL-32表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明TGF-β1和IL-32水平參與了CBD疾病的發(fā)生發(fā)展，可通過促進膽道細胞增殖分化、促進組織的修復(fù)，調(diào)節(jié)炎癥免疫功能，有利于病情程度的判定和監(jiān)測。

IL-32是一種新型的細胞因子，參與炎癥和癌癥的發(fā)生，其基因主要由8個小外顯子組成，IL-32最初是通過有絲分裂原和激活的自然殺傷細胞在激活的T細胞中選擇性表達的，在各種人體組織和器官中廣泛表達，如肺、肝臟、肌肉、腎臟、胰腺和大腦[3]。既往研究表明，IL-32在多種炎癥性疾病患者中上調(diào)，是一種主要的促炎因子，由炎性反應(yīng)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[3,5,14-15]。本研究中CBD患兒IL-32與病情嚴重度明顯相關(guān)，考慮CBD患兒中主要是大量炎性因子的釋放導(dǎo)致肝細胞損傷，觸發(fā)一系列的生物學反應(yīng)，促進肝纖維化發(fā)生，出現(xiàn)膽道狹窄，從而引起膽道的膽管擴張。

本研究中CBD患兒的TGF-β1、IL-32水平與肝功能指標(ALT、AST及γ-GGT)呈正相關(guān)，與以往研究結(jié)果較為一致[5]。其中TGF-β1可加重炎性反應(yīng)和繼發(fā)組織的纖維化[9]。IL-32水平升高與肝炎活動明顯相關(guān)，主要是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB 信號通路或加強協(xié)同刺激分子B7-H6與自然殺傷細胞表面受體NKP30相互作用，可促進IL-32的表達，促進肝細胞凋亡[4]。肝功能指標(ALT、AST)在肝細胞受損時能夠釋放入血，是反映肝功能受損的常用指標[16]。由于膽管擴張易引起炎性反應(yīng)和膽道梗阻性黃疸[4-5]。因此，CBD患兒TGF-β1、IL-32水平與肝功能嚴重度明顯相關(guān)。

綜上所述，TGF-β1、IL-32水平在CBD患兒中及疾病進展起著重要作用，其代表肝損傷的炎癥程度和纖維化水平，為CBD患兒尋求靶向針對TGF-β1、IL-32的新型藥物治療方法的設(shè)計開辟了新的途徑。