嚴(yán)重燙傷MODS小鼠的sTREM-1抗炎作用研究*

駱沿極，劉安娜，王占科，肖創(chuàng)清△，胡亞芳

1.湖南師范大學(xué)附屬第二醫(yī)院/中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第921醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長沙 410000； 2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908 醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌 330002

髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1(TREM-1)是在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上表達(dá)的一種細(xì)胞表面受體。TREM-1與DNA激活蛋白12(DAP12)結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，通過與Toll 樣受體(TLR)信號的協(xié)同作用，觸發(fā)并放大炎性反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥因子釋放[1-2]。細(xì)菌脂多糖(LPS)即內(nèi)毒素的化學(xué)成分，劑量依賴性地增加細(xì)胞表面TREM-1的表達(dá)[3]。LPS的刺激會誘導(dǎo)TREM-1內(nèi)源性配體的釋放，釋放的內(nèi)源性配體功能性地激活TREM-1[2]?？扇苄运铇蛹?xì)胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)是TREM-l的可溶形式，具有TREM-1的胞外區(qū)(Ig樣結(jié)構(gòu)域)即負(fù)責(zé)配體結(jié)合的位點(diǎn)[4-5]。正常情況下sTREM-1/LPS比值應(yīng)相對恒定。本研究探討嚴(yán)重燙傷多器官功能障礙綜合征(MODS)小鼠sTREM-1/LPS比值變化及sTREM-1的抗炎作用，以期對臨床治療MODS提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料 無特定病原體(SPF)級的昆明小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(贛)2018-0003，質(zhì)量合格證號0001516 ]； LPS(Escherichia coli O55:B5，美國sigma公司)；TREM-1/Fc融合蛋白(美國R&D Systems公司)。

1.2儀器與試劑 HH-W21 型電熱恒溫水浴箱購自上海醫(yī)用恒溫設(shè)備有限公司。BS2000全自動(dòng)生化分析儀購自深圳邁瑞生物技術(shù)有限公司。DL-ET32微生物動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)由珠海迪爾生物工程有限公司生產(chǎn)。RT-3100全自動(dòng)洗板機(jī)購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。KHB ST-360酶標(biāo)儀由上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)。UPT-3A 上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀由北京熱景生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(CRE) 和肌酸激酶同工酶(CK-MB) 生化測定試劑盒由深圳邁瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。LPS動(dòng)態(tài)濁度法測定試劑盒由珠海迪爾生物工程有限公司生產(chǎn)。TNF-α和sTREM-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒由上海澤葉生物科技有限公司生產(chǎn)。IL-6上轉(zhuǎn)發(fā)光法測定試劑盒由北京熱景生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3動(dòng)物模型制作及給藥 本研究由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第921醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。200 只SPF級的昆明小鼠無菌包裝條件下，運(yùn)送至解放軍第908 醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[許可證編號 SYXK(贛) 2013-001]，全膜終端過濾式獨(dú)立送風(fēng)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為燙傷1 d組(30只)、燙傷3 d組(30只)、燙傷5 d組(30只)、TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組(30只)、TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組(30只)、TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組(30只)和對照組(20只)。小鼠麻醉后背部剪毛，除對照組外浸入90 ℃水中10 s，達(dá)到30%體表面積Ⅲ度燙傷。傷后 2 h 小鼠腹腔注射1.0 mL LPS(按5 mg/kg體質(zhì)量注射：0.1 mg/mL)，同時(shí)腹腔注射1.0 mL生理鹽水抗休克。燙傷1 d組、燙傷3 d組和燙傷5 d組小鼠的肝功能、腎功能和心肌酶等指標(biāo)高于對照組，表示嚴(yán)重燙傷MODS小鼠模型制作成功[6-8]。將對照組小鼠背部浸入室溫水中10 s，除假燙傷和不注射LPS外，其他處理方式均與燙傷1 d組、燙傷3 d組、燙傷5 d組相同。LPS注射1 h后，TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組、TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組、TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組小鼠腹腔注射0.2 mL用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的TREM-1/Fc融合蛋白溶液(按1 μg/kg體質(zhì)量注射：0.1 μg/mL)[9-10]。TREM-1/Fc融合蛋白溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。其他組注射等體積PBS。

1.4標(biāo)本采集及指標(biāo)測定 各組小鼠麻醉后進(jìn)行心臟采血[11]。所有小鼠在采血前禁食12 h，可以自由飲水。各組的死亡小鼠未進(jìn)行采血(小鼠死亡時(shí)間不固定)。燙傷1 d組和TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組在燙傷后第1天采血。燙傷3 d組和TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組在燙傷后第3天采血。燙傷5 d組和TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組在燙傷后第5天采血。對照組適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后空腹12 h即可采血。血液用肝素鈉抗凝。離心后，分離血漿并保存在-80 ℃的冰箱中。測量相關(guān)指標(biāo)時(shí)，各組小鼠血漿統(tǒng)一凍融，嚴(yán)格按照指標(biāo)的檢測試劑盒說明書測定。ALT(IFCC法)、CRE(肌氨酸氧化酶法)和 CK-MB(免疫抑制法)在BS2000全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行測定。LPS(動(dòng)態(tài)濁度法)在DL-ET32微生物動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)進(jìn)行測定。sTREM-1(ELISA法)和 TNF-α(ELISA法)在KHB ST-360酶標(biāo)儀上進(jìn)行測定。IL-6(上轉(zhuǎn)發(fā)光法)在UPT-3A 上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀上進(jìn)行測定。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠病死率情況比較 燙傷1 d組小鼠病死率(13.33%)和TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組(6.67%)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；燙傷3 d組小鼠病死率(33.33%)和TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組(16.67%)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組小鼠病死率(20.00%)小于燙傷5 d組(50.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組小鼠主要臟器功能指標(biāo)水平比較 燙傷1 d組、燙傷3 d組、燙傷5 d組小鼠ALT、CRE 和CK-MB高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組、TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組、TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組小鼠ALT、CRE 和CK-MB高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。燙傷1 d組小鼠ALT、CRE、CK-MB和TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組小鼠ALT、CRE 和CK-MB低于燙傷3 d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組小鼠ALT、CRE和CK-MB低于燙傷5 d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠 ALT、CRE 和CK-MB水平比較

2.3各組小鼠血漿sTREM-1/LPS比值比較 燙傷1 d組[(8.82±1.06)]、燙傷3 d組[(6.78±0.93)]、燙傷5 d組[(7.37±0.86)]和TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組[(6.47±0.89)]、TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組[(4.85±0.72)]、TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組小鼠血漿sTREM-1/LPS比值[(5.41±0.84)]與對照組[(32.99±3.14)]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組血漿sTREM-1/LPS比值[(6.47±0.89)]低于燙傷1 d組[(8.82±1.06)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組血漿sTREM-1/LPS比值[(4.85±0.72)]低于燙傷3 d組[(6.78±0.93)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組血漿sTREM-1/LPS比值[(5.41±0.84)]低于燙傷5 d組[(7.37±0.86)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

2.4各組小鼠TNF-α和IL-6水平比較 燙傷1 d組、燙傷3 d組、燙傷5 d組小鼠TNF-α和IL-6高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組、TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組、TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組TNF-α和IL-6高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組小鼠TNF-α和IL-6低于燙傷1 d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組小鼠TNF-α和IL-6低于燙傷3 d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組小鼠TNF-α和IL-6低于燙傷5 d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠 TNF-α和IL-6水平比較

3 討 論

MODS是重癥患者最常見的危重癥候群之一，也是導(dǎo)致重癥患者死亡的主要原因[7]。敗血癥是MODS最常見的誘因，通常使用LPS進(jìn)行研究。嚴(yán)重創(chuàng)傷和LPS誘發(fā)強(qiáng)烈的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，失調(diào)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致促炎和抗炎之間的穩(wěn)態(tài)失衡，這是MODS發(fā)展的關(guān)鍵[12-13]。誘發(fā)因素、SIRS和多器官功能障礙是MODS診斷的重要依據(jù)[6]。肝、腎和心是人類MODS常累及的器官種類，ALT屬于肝功能指標(biāo)，CRE屬于腎功能指標(biāo)，CK-MB屬于心肌酶譜。本研究采用燙傷加腹腔注射LPS的二次打擊模型，誘因明確，器官功能指標(biāo)與嚴(yán)重燙傷MODS大鼠模型相同。在嚴(yán)重燙傷MODS大鼠模型中，燙傷后各時(shí)點(diǎn) ALT、CRE和CK-MB 高于燙傷前，并持續(xù)到燙傷后數(shù)天，表明多臟器出現(xiàn)功能明顯異常[14-15]。本研究中，燙傷1 d組、燙傷3 d組和燙傷5 d組小鼠ALT、CRE和CK-MB高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，多個(gè)重要器官功能指標(biāo)出現(xiàn)明顯異常，表明嚴(yán)重燙傷MODS 小鼠模型制作成功。小鼠炎性因子TNF-α和IL-6水平也升高，表明嚴(yán)重燙傷MODS小鼠同時(shí)具有內(nèi)毒素血癥、SIRS和多器官功能障礙。

LPS的誘導(dǎo)是TREM-1激活所必需的，LPS劑量依賴性地增加細(xì)胞表面TREM-1的表達(dá)[2-3]，TREM-1的胞外區(qū)切下[5]或TREM-1 mRNA的剪接變體翻譯[1]形成sTREM-1，表明正常情況下sTREM-1/LPS比值相對恒定。本研究運(yùn)用sTREM-1/LPS比值評估小鼠血漿sTREM-1相對LPS是否缺乏，結(jié)果顯示,燙傷1 d組、燙傷3 d組、燙傷5 d組小鼠血漿sTREM-1/LPS比值與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。sTREM-1缺乏跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，因此缺乏信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，但它具有TREM-1的胞外域，即負(fù)責(zé)配體結(jié)合的位點(diǎn)[4]。嚴(yán)重燙傷MODS小鼠發(fā)生內(nèi)毒素血癥，但與健康小鼠對比，血漿sTREM-1相對LPS不足，原因可能是sTREM-1與細(xì)胞表面TREM-1競爭結(jié)合TREM-1內(nèi)源性配體導(dǎo)致血漿中游離的sTREM-1相對不足[16]。若釋放的sTREM-1足夠，在與內(nèi)源性配體結(jié)合后，血漿sTREM-1/LPS比值仍應(yīng)與對照組接近。TREM-1激活后觸發(fā)并擴(kuò)大炎性反應(yīng)[5]，sTREM-1充當(dāng)誘餌受體與TREM-1內(nèi)源性配體結(jié)合，抑制了TREM-1的活化，因此，sTREM-1可能起抗炎作用[4,10]。TREM-1/Fc融合蛋白為包含鼠TREM-1胞外域和人IgG1 Fc部分的融合蛋白，相當(dāng)于sTREM-1，具有負(fù)責(zé)配體結(jié)合的位點(diǎn)[10,17]。與未接受治療的MODS小鼠對比，TREM-1/Fc融合蛋白治療的小鼠血漿sTREM-1/LPS比值降低，即sTREM-1相對LPS進(jìn)一步降低，原因可能是注入了足量的TREM-1/Fc融合蛋白，其代替sTREM-1充當(dāng)誘餌受體。雖然LPS刺激會誘導(dǎo)TREM-1內(nèi)源性配體的釋放，這種內(nèi)源性配體能夠功能性激活TREM-1[2]，但TREM-1/Fc融合蛋白競爭結(jié)合釋放的內(nèi)源性配體，激活TREM-1的配體數(shù)量減少，TREM-1的表達(dá)減少，產(chǎn)生的sTREM-1也就相對減少。因此，sTREM-1/LPS比值有兩種意義。在進(jìn)行TREM-1/Fc融合蛋白(或sTREM-1)治療前，sTREM-1/LPS比值可用于評估血漿sTREM-1相對LPS是否缺乏，若缺乏則下降；在進(jìn)行TREM-1/Fc融合蛋白(或sTREM-1)治療后，sTREM-1/LPS比值可用于評估TREM-1/Fc融合蛋白是否有效及用量是否足夠，若足夠則進(jìn)一步下降。

TNF-α和IL-6均為促炎細(xì)胞因子，在炎性反應(yīng)中起著重要作用[18-19]。激活TREM-1能夠觸發(fā)并擴(kuò)大炎性反應(yīng)，促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生、炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，包括TNF-α和IL-6[5]。TREM-1/Fc融合蛋白為包含鼠TREM-1胞外域和人IgG1 Fc部分的融合蛋白，相當(dāng)于sTREM-1，具有負(fù)責(zé)配體結(jié)合的位點(diǎn)[10,17]。為了驗(yàn)證sTREM-1的抗炎作用，將TREM/Fc融合蛋白溶液注入小鼠體內(nèi)，觀察到TREM-1/Fc融合蛋白治療1 d組小鼠TNF-α和IL-6低于燙傷1 d組，TREM-1/Fc融合蛋白治療3 d組小鼠TNF-α和IL-6低于燙傷3 d組，TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組小鼠TNF-α和IL-6低于燙傷5 d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TREM-1/Fc融合蛋白治療5 d組小鼠病死率小于燙傷5 d組(P<0.05)。以上結(jié)果證實(shí)了TREM-1/Fc融合蛋白或sTREM-1具有抗炎作用并能有效降低MODS的病死率。

燙傷加腹腔注射LPS的二次打擊模型能更好地復(fù)制人類燙傷MODS。燙傷后感染造成的內(nèi)毒素血癥是導(dǎo)致燙傷MODS的重要原因[20]。盡管燙傷后自然感染或創(chuàng)面接種細(xì)菌的方法更接近人類燙傷MODS的發(fā)生過程，但這些方法存在不足，如模型不穩(wěn)定，復(fù)制時(shí)間較長等。本研究采用的燙傷MODS模型，腹腔注射的LPS劑量容易控制，復(fù)制時(shí)間較短，形成MODS的時(shí)間比較集中，燙傷小鼠MODS表現(xiàn)典型，而且制作嚴(yán)重燙傷MODS模型，只探討sTREM-1在嚴(yán)重燙傷MODS中的抗炎作用，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與單純的燙傷模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否存在差異，尚需進(jìn)一步研究。