Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子在口腔扁平苔蘚患者血清和唾液中的表達(dá)及臨床意義

柳惠榮

(菏澤市中醫(yī)醫(yī)院口腔科，山東 菏澤 274035)

口腔扁平苔蘚(OLP)是一種多因素誘發(fā)的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。有研究表明，免疫因素在OLP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。OLP根據(jù)病損基底部黏膜狀況可分為糜爛型OLP(EOLP)和非糜爛型OLP(NEOLP)。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等)和某些非免疫細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子在OLP的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用[1-3]。本研究應(yīng)用流式微球分析(CBA)技術(shù)，即微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)檢測OLP患者血清和唾液中Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子水平，旨在更深入地了解OLP發(fā)病機(jī)理。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年10月本院口腔科OLP患者26例，并分為NEOLP組(14例)和EOLP組(12例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)詳細(xì)詢問病史及常規(guī)口腔檢查，根據(jù)臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)檢查診斷為口腔扁平苔蘚；(2)全身無系統(tǒng)性疾病，如糖尿病、高血壓、腫瘤、貧血等；(3)近3個(gè)月內(nèi)未使用激素類或免疫抑制劑類藥物等；(4)無重度牙周病及其他口腔黏膜?。?5)1個(gè)月內(nèi)未使用抗生素類藥物，3個(gè)月內(nèi)未使用過免疫制劑者。NEOLP組中男5例，女9例，中位年齡38歲(17～62歲)。EOLP組中男4例，女8例，中位年齡39歲(17～60歲)。同時(shí)選取無口腔、皮膚扁平苔蘚病史及其他系統(tǒng)性疾病史等健康志愿者25例作為對照組，其中男9例，女16例，中位年齡40歲(17～62歲)。所有研究對象均簽署知情同意書。3組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 于清晨采取患者空腹靜脈血2 mL，對照組則在體檢時(shí)抽取，離心15 min后取血清，置于—80 ℃冰箱保存。于上午9：00點(diǎn)左右收集非刺激性全唾液2 mL。在收集樣本前2 h內(nèi)禁食、禁飲或任何口腔衛(wèi)生措施等。在2 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，離心10 min后棄沉淀，取上清液置于—80 ℃冰箱保存。測試前室溫解凍樣本，應(yīng)用CBA技術(shù)，采用流式細(xì)胞儀(美國BD公司)測定血清和唾液中Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子濃度，包括白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ-干擾素(IFN-γ)。操作按照試劑盒(江西諾德醫(yī)療器械有限公司)操作說明書進(jìn)行。每個(gè)樣本管中加入25 μL捕獲微球混合液后離心5 min，吸取上清，加入等體積微球緩沖液，混勻后室溫避光30 min；加入待測樣本和熒光檢測試劑各25 μL，充分混勻后室溫避光孵育2.5 h；隨后加入1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，離心5 min，吸取上清，再加入0.3 mL PBS上機(jī)檢測。采用CELLQuest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.13組血清Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子水平比較 3組血清IL-2、IL-10和IFN-γ水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。EOLP組和NEOLP組血清IL-4、IL-6、IL-17A和TNF-α水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EOLP組上述各指標(biāo)與NEOLP組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組血清Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子水平比較

2.23組唾液中Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子水平比較 三組唾液中IL-2、IL-10和IFN-γ水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。EOLP組和NEOLP組唾液中IL-4、IL-6、IL-17A和TNF-α水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EOLP組上述各指標(biāo)與NEOLP組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組唾液中Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子水平比較

2.3血清和唾液中Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子水平相關(guān)性分析 血清和唾液中Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子水平無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 血清和唾液中Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因子水平相關(guān)性分析

3 討 論

OLP是一種常見的口腔黏膜慢性炎性疾病，表現(xiàn)為患病部位疼痛、粗糙不適。目前，臨床認(rèn)為OLP是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[1-3]。CD4+T細(xì)胞分可化為Th1、Th2和Th17細(xì)胞等，其中Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)性超敏反應(yīng)；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子，與體液免疫相關(guān)。OLP大致分為糜爛型和非糜爛型(以網(wǎng)紋型為主)，二者發(fā)病機(jī)理是否存在一定差異，相關(guān)研究較少見。CBA技術(shù)是一個(gè)基于流式細(xì)胞檢測系統(tǒng)的多重蛋白定量檢測方法，能夠同時(shí)對單個(gè)樣品中的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測，具有高通量、高特異性、高靈敏性、操作簡便、低成本、重復(fù)性好、快速檢測等優(yōu)勢，縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。

IL-4主要作用為促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分化，刺激B細(xì)胞合成免疫球蛋白E。OLP患者血清及唾液中IL-4水平均高于健康人[4]，其外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的組蛋白H3位乙?；綍?huì)降低。采用CBA技術(shù)測定外周血40種細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，乙酰化水平與IL-4和人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平呈負(fù)相關(guān)，這解釋了IL-4增高的原因[5]。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，是一種促炎細(xì)胞因子，可增強(qiáng)T細(xì)胞對IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度[6]。WANG等[2]研究顯示，OLP患者外周血及受損局部組織IFN-γ和IL-4水平均增高，且IFN-γ/IL-4比值增高，提示存在Th1/Th2免疫失衡。陳瓊等[7]研究發(fā)現(xiàn)，OLP患者血清IFN-γ水平降低和IL-4水平增高導(dǎo)致IFN-γ/IL-4比值降低是OLP的免疫病因?qū)W因素之一，且IL-17蛋白表達(dá)增高主要與EOLP炎癥過程有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，OLP患者血清和唾液中IFN-γ水平與健康人比較無顯著差異，且EOLP型和NEOLP型之間也無顯著差異；IL-4水平增高程度與IL-6、IL-17A和TNF-α比較并不明顯。因此，IFN-γ和IL-4水平變化是否在OLP發(fā)病過程中起主要作用有待于進(jìn)一步研究。

IL-10是由單核巨噬細(xì)胞分泌的介導(dǎo)免疫抑制的細(xì)胞因子，其能夠抑制Th1細(xì)胞合成IL-2和IFN-γ。有研究顯示，OLP患者唾液中IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ水平增高[8]。WEI等[3]采用CBA技術(shù)測定OLP患者細(xì)胞因子，結(jié)果顯示，唾液中IL-6、IL-10和IFN-γ水平增高，并且增高程度與疾病嚴(yán)重程度呈一定相關(guān)性。ZHOU等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-10水平與健康人相比無顯著差異。一項(xiàng)薈萃分析顯示，OLP患者IL-10水平變化有增高、無變化、降低等不同結(jié)果[10]。本研究結(jié)果顯示，血清和唾液中IL-10和IFN-γ水平并不增高。不同研究結(jié)果差異較大的原因可能與患者疾病嚴(yán)重程度、樣本來源、測定時(shí)機(jī)等多種因素有關(guān)。

IL-6是由成纖維細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞所產(chǎn)生，具有多種生物學(xué)作用，如誘導(dǎo)B細(xì)胞分化，誘導(dǎo)IL-2和IL-2受體表達(dá)等。一項(xiàng)薈萃分析顯示，NEOLP組、EOLP組患者血清和唾液中IL-6水平增高但無顯著差異，且唾液中IL-6水平增高更加明顯，提示測定唾液中IL-6水平有助于OLP的診斷及治療監(jiān)測[11-12]。本研究結(jié)果顯示，NEOLP組、EOLP組唾液中IL-6水平均高于血清IL-6水平。提示可能測定唾液中IL-6水平更加具有臨床意義。李新等[13]應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測OLP患者唾液中氧化應(yīng)激指標(biāo)和核因子-κB相關(guān)炎癥因子，用氧化應(yīng)激損傷的產(chǎn)物來反映氧化應(yīng)激水平，如脂質(zhì)過氧化損傷產(chǎn)生的丙二醛(MDA)，DNA氧化損傷產(chǎn)生的8-羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)等能間接反映體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果顯示，NEOLP組、EOLP組MDA、8-OHDG、TNF-α、IL-6和IL-8水平增高，提示OLP患者存在高氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激參與OLP的發(fā)生與發(fā)展。KAUR等[14]研究顯示，OLP患者血清和唾液中IL-6、IL-8和TNF-α水平均增高，且血清和唾液中這些指標(biāo)存在一定相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，血清和唾液中7種細(xì)胞因子水平無相關(guān)性。血清與唾液中細(xì)胞因子來源是否一致有待于進(jìn)一步研究。OLP患者血清和唾液中IL-10水平在糜爛組、網(wǎng)紋組及對照組之間無顯著差異，而TNF-α水平在糜爛組和網(wǎng)紋組中增高，且糜爛組TNF-α水平高于網(wǎng)紋組[15]。本研究結(jié)果顯示，血清和唾液中IL-10水平在各組間無顯著差異。OLP患者口腔成成纖維細(xì)胞在牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激下表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白，具有肌成纖維細(xì)胞的特性，可以分泌IL-6、IL-8和TNF-α[16]。因此，成纖維細(xì)胞可能是這些細(xì)胞因子的來源之一。

IL-17A是Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子，與炎癥發(fā)展、免疫應(yīng)答、免疫排斥等多種生物學(xué)活性有關(guān)。OLP患者血清IL-17A水平較健康人增高，但不同疾病類型之間無顯著差異，且IL-17A G197A基因多態(tài)性與OLP有一定相關(guān)性，GA或AA型更加容易發(fā)生OLP[17]。KAUR等[14]研究發(fā)現(xiàn)，EOLP組唾液中IL-17水平高于網(wǎng)紋組和對照組，且IL-17水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。毛其芬等[18]采用ELISA測定OLP患者外周血細(xì)胞因子水平，EOLP組IL-17水平增高，而NEOLP組IL-4、IL-10水平增高。

綜上所述，血清和唾液中IL-4、IL-6、IL-17A和TNF-α水平變化是促進(jìn)OLP的部分原因。唾液在標(biāo)本采集方面比血清有優(yōu)勢，運(yùn)用唾液細(xì)胞因子將OLP病情量化可為其后續(xù)治療及隨訪監(jiān)測提供依據(jù)。各種細(xì)胞因子異常變化在不同研究中得到的結(jié)果存在一定差異，可能與不同病情嚴(yán)重程度、患者年齡和性別影響、測定方法不同等因素有關(guān)。本研究采用CBA技術(shù)同時(shí)測定7種細(xì)胞因子，具有明顯優(yōu)勢。針對異常變化細(xì)胞因子的治療，如IL-6和TNF-α的單克隆抗體是否能夠成為治療OLP的新措施需要進(jìn)一步研究。