原發(fā)性開角型青光眼家系致病基因檢測及其啟動子區(qū)域甲基化的關(guān)系

李思媛 鄭娟 翟玉喜 顧明亮 高建魯

青光眼是一種以視神經(jīng)損傷和相應(yīng)視功能損害為特征的視神經(jīng)疾病，是僅次于白內(nèi)障的致盲性疾病。全球約有6050萬原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)患者，到2020年該病患者的數(shù)量將達(dá)7960萬[1]。POAG的發(fā)病機(jī)制目前普遍認(rèn)為是基因與環(huán)境等多種因素相互作用導(dǎo)致的疾病[2]。迄今，通過對符合孟德爾遺傳的青光眼家系進(jìn)行連鎖分析，定義了20多個青光眼遺傳位點，并鑒定了可能的青光眼致病基因[3]。對于大多數(shù)青光眼家系，其受累個體往往在成年后發(fā)病，具有延遲發(fā)病和不完全外顯的特點。通過數(shù)十年模式生物的研究，已經(jīng)證明表觀遺傳機(jī)制對基因組功能的調(diào)控具有重要作用[4]，包括組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾、胞嘧啶(C)甲基化和non-coding RNA的調(diào)節(jié)等[5]。甲基化的特點是DNA 序列不發(fā)生改變的情況下調(diào)控基因的表達(dá)，調(diào)節(jié) DNA 重組、保證染色體完整性和某些基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性[6]。本研究通過分析一個POAG家系，確定其致病基因，并分析基因和表型的關(guān)系，初步探測基因甲基化修飾對遲發(fā)性的意義。

資料與方法

一、一般資料

獲得一個呈孟德爾顯性遺傳模式的POAG家系的血樣本及臨床資料(標(biāo)準(zhǔn)為邯鄲眼科研究標(biāo)準(zhǔn)，所有樣本由聊城市人民醫(yī)院提供，研究通過倫理委員會的審查，所有受試者均簽署知情同意書)。該家系符合“孟德爾遺傳青光眼家系較適合連鎖分析”的要求，共81例，生存78例，其中患者10例(圖1)。

圖1 POAG家系成員組成及受累情況

表1 家系部分患者的臨床資料

二、POAG診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.有青光眼性視盤損害和(或)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層缺損；

2.青光眼性視野缺損；

3.前房角開放，具有以上3項并排除繼發(fā)性開角型青光眼。僅眼壓大于21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或青光眼激發(fā)試驗(如飲水試驗和暗室俯臥試驗)陽性應(yīng)診斷為可疑。

三、方法

1.臨床資料收集：詳細(xì)詢問該家系家族史(已故者信息詢問其家庭成員獲得)，并進(jìn)行詳細(xì)的眼科?？茩z查，包括視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡檢查、房角鏡檢查、眼前節(jié)照相、眼底檢查及Humprey視野檢查、海德堡視網(wǎng)膜斷層掃描儀(Heidelberg retinal tomography II,HRT-II)。

2.DNA的提取：抽取家系成員靜脈血5 ml，EDTA抗凝，-4 ℃保存，采用氯仿法提取外周血細(xì)胞DNA，-80 ℃保存。

3.致病基因檢測：對該家系所有成員進(jìn)行致病基因檢測。應(yīng)用芯片捕獲測序技術(shù)，捕獲POAG相關(guān)基因所有的外顯子及剪切位點，通過高通量測序檢測這些基因的突變情況，對于高通量測序中出現(xiàn)的可疑致病位點，再行Sanger測序驗證。

4.檢測家系外周血中MYOC甲基化水平：使用MethPrimer http://www.uro-gene.org/methprimer預(yù)測致病基因啟動子CPG島，設(shè)計甲基化引物，重硫酸鹽處理全基因組DNA，一代測序檢測DNA甲基化程度，并行聚類分析。

結(jié) 果

一、家系基本情況

該家系共5代，81人，其中患者12人(已故2人。5代中最年輕的一代尚未出現(xiàn)表型，其余均有患者出現(xiàn)，發(fā)病年齡在15～38歲，具有遲發(fā)性特點。

二、家系患者眼部情況及特點

先證者，家系編號II-3，女，48歲，確診時間為34歲。間斷降眼壓藥物治療(卡替洛爾滴眼液、布林佐胺滴眼液，2年前加用曲伏前列素滴眼液)，眼壓控制欠佳，視野右眼為管狀視野，C/D=1.0，左眼弓形缺損，C/D=0.3。因視野損失逐漸加重，于2017年行雙眼小梁切除術(shù)。部分家系患者現(xiàn)在眼部情況及治療結(jié)果(表1)。

根據(jù)家系成員青光眼確診時間，考慮為青少年型青光眼，確診時均行視野檢查，提示有視野缺損，嚴(yán)重者雙眼無光感；眼壓在多種藥物及手術(shù)和選擇性激光小梁成形術(shù)的控制下，均在正常范圍。隨著年齡增長，家系內(nèi)發(fā)病個體逐漸增加，表現(xiàn)出一定的遲發(fā)特征。

三、家系致病基因

在rs10911021的位置有一個與青光眼候選基因重疊的連鎖峰，其LOD值為3.302，NPL值為16.67，位于染色體1q24.2～25.3(圖2)，該區(qū)域遺傳距離約14Mb，其中的MYOC為候選致病基因。然后，我們對該基因進(jìn)行Sanger測序，在其MYOC G1099A鑒定出致病突變(G367R)(圖3)。

圖2 POAG家系致病基因的染色體定位

圖3 POAG家系MYOC G1099A突變的測序峰圖

四、致病基因的甲基化測序結(jié)果

患者、突變攜帶者及正常者，MYOC 上游0bp至-2000bp 啟動子區(qū)內(nèi)F1-R1 CG位點的檢測如熱圖所示(圖4)。3組甲基化豐度水平的改變，在疾病亞組之間無明顯差異。

圖4 疾病亞組之間Myoc甲基化聚類

討 論

POAG遺傳背景復(fù)雜，是多基因參與的高度遺傳異質(zhì)性疾病。迄今，通過家系的連鎖研究定義了29個青光眼遺傳位點，并鑒定了12個可能的青光眼致病基因[7]，其中包括MYOC[8]、OPTN[9]、CYP1B1[10]、WDR36[11]，ASB10和NTF4等等[12]。隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，多個臨床研究中心通過基因組測序、外顯子測序、GWAS 、基因芯片等方法，對大量的青光眼家系及散發(fā)人群從POAG的內(nèi)在表型、線粒體、小梁網(wǎng)等相關(guān)基因進(jìn)行檢測，又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了約50個可能青光眼遺傳位點[13]。但是由于POAG遺傳背景的復(fù)雜性，這些基因的發(fā)現(xiàn)僅解釋了不到10%POAG患者的發(fā)病原因[14]，在絕大多數(shù)POAG患者中這些變異都是罕見的。因此，繼續(xù)通過遺傳家系、大樣本及多中心研究進(jìn)行致病基因的篩選、鑒定，敏感位點的定位和功能研究仍然是青光眼領(lǐng)域研究的熱點。

正是這些決定基因的存在，啟動一系列下游相關(guān)基因的級聯(lián)信號通路，誘導(dǎo)POAG的發(fā)生與發(fā)展。在本研究的家系中，患者攜帶相同致病基因，但發(fā)病年齡存在明顯差異，個體間發(fā)病年齡的時間跨度能達(dá)10余年之久，即存在疾病遲發(fā)現(xiàn)象。我們推測POAG遲發(fā)實質(zhì)上就是生物進(jìn)化出來的對環(huán)境適應(yīng)性的表觀響應(yīng)機(jī)制。環(huán)境因素如飲食、肥胖、吸煙、日曬和年齡能引起基因組表觀層面的改變，例如DNA甲基化，組蛋白甲基化，組蛋白乙酰化等。Jünemann 等研究發(fā)現(xiàn)青光眼患者的外周單核細(xì)胞中總的DNA甲基化水平比健康人存在明顯的升高[15]。Fiona等進(jìn)一步利用ELISA方法檢測人青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞系和正常小梁網(wǎng)細(xì)胞系中總的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)人青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞系DNA甲基化水平高。低氧處理正常細(xì)胞系后，會出現(xiàn)與青光眼細(xì)胞系相似的甲基化與基因表達(dá)結(jié)果。說明低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)DNA甲基化水平改變，從而使相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)而誘發(fā)青光眼[16，17]。

本研究中我們初步應(yīng)用全基因組甲基化測序檢測基因組上的差異甲基化區(qū)域，擬找到受不同環(huán)境因素刺激的個體間的表觀分子差異。但結(jié)果并不理想，考慮一代測序的局限性，測序開始的50個堿基可能存在序列的錯誤，以及樣本量偏少，可能存在偏差。因此，擴(kuò)大樣本量檢查，重新調(diào)整檢測方法，或得到可觀的效果，而繼續(xù)行青光眼家系的遺傳研究，將有利于POAG復(fù)雜發(fā)病機(jī)制的闡明，而且對POAG預(yù)防、早期診斷和治療具有潛在的應(yīng)用價值。