PI3K/AKT介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路在百草枯中毒致心臟損傷中的作用

李玉華，袁媛，王韞文，趙敏

百草枯(paraquat，PQ)是一種高效廣譜、廉價(jià)的非選擇性接觸性除草劑，其中毒是全球范圍內(nèi)最主要的中毒事件之一，且目前沒(méi)有特效解毒藥物和治療方案。PQ攝入對(duì)包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物具有劇毒，可損傷多器官，包括肺、腎、肝、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等，導(dǎo)致全身多器官功能衰竭甚至死亡，其中心臟損傷是百草枯中毒死亡的重要原因之一[1-6]。目前關(guān)于PQ毒性作用的機(jī)制尚未完全闡明，但既往有報(bào)道表明該化學(xué)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)及由此誘發(fā)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1]。過(guò)量活性氧自由基的釋放及氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞大分子的氧化修飾，抑制蛋白質(zhì)功能，并最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是人體內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在調(diào)控細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、增殖凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。該信號(hào)通路通過(guò)直接或間接調(diào)控凋亡相關(guān)因子參與細(xì)胞凋亡的不同階段，使其與心血管疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中心肌細(xì)胞凋亡程度密切相關(guān)，在心肌細(xì)胞存活和程序性死亡的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[9]。PQ中毒誘導(dǎo)的心臟毒性損傷可破壞心肌細(xì)胞的氧化抗氧化平衡，造成心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的蓄積，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死，大量心肌細(xì)胞壞死和凋亡進(jìn)一步加重心臟損傷的嚴(yán)重程度[10]。目前，對(duì)于PQ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究尚不完善，本研究旨在探討PI3K/AKT介導(dǎo)的抗凋亡信號(hào)通路在百草枯中毒心臟損傷過(guò)程中的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物:清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室內(nèi)溫度20～25℃、濕度40%～70%，晝夜節(jié)律12 h，自由進(jìn)食水。(2)試藥試劑：百草枯(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物公司)；β-actin抗體(美國(guó)Proteintech公司)，PI3K和p-PI3K抗體(美國(guó)Affinity Bioscience公司)，AKT、p-AKT、Bax(美國(guó)Cell Signaling technology公司)，Bcl-2、Caspase-3(美國(guó)Abcam公司)；其余均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。(3)儀器設(shè)備：生物組織石蠟包埋機(jī)、組織脫水機(jī)、烘片機(jī)、全自動(dòng)組織染片機(jī)(德國(guó)Leica公司)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年7月—2020年1月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪基地實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 并經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。雄性SD大鼠20只隨機(jī)數(shù)字表法均分為2組，每組10只。百草枯中毒組(PQ組)：按照百草枯20 mg/kg腹腔注射；對(duì)照組(CON組)：等體積生理鹽水腹腔注射。 2組大鼠于腹腔注射48 h后，以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥位固定于鼠臺(tái)上，常規(guī)消毒后，打開(kāi)胸腔及腹腔，暴露胸、腹腔內(nèi)各臟器，并觀察心臟、肺臟、肝臟、腎臟的形態(tài)學(xué)變化；經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈采血2 ml，經(jīng)室溫靜置>2 h后，4℃離心收集上清液置于-80℃保存?zhèn)溆?；而后無(wú)菌條件下迅速剝離心臟，放入冰生理鹽水中，除去雜質(zhì)及脂肪，洗凈殘留的血液，并用濾紙吸干多余水分；部分心臟置于-80℃保存以備檢測(cè)，部分置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上，以備HE病理染色檢測(cè)，觀察心肌組織結(jié)構(gòu)。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 心臟組織損傷觀察：上述4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上的心臟，經(jīng)梯度脫水石蠟包埋，連續(xù)切片厚度5 μm，并行HE染色，然后將切片脫水并固定，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)。

1.3.2 心肌酶檢測(cè)：(1)CK、 LDH活性，上述大鼠腹主動(dòng)脈采血2 ml離心留取血清，使用CK、LDH測(cè)定試劑盒并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清CK和LDH活性，評(píng)估心肌細(xì)胞損傷；(2)SOD、MDA吸光度，取心臟組織100 mg攪碎后溶于緩沖液中做成5%組織勻漿，采用BCA法測(cè)定SOD和MDA。根據(jù)SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用96孔板在460 nm測(cè)量組織勻漿中SOD、MDA的吸光度值。整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格按照SOD和MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.3.3 心臟組織相關(guān)蛋白表達(dá)：使用Western-blot法檢測(cè)組織細(xì)胞總蛋白。取上述置于-80℃保存的部分心臟組織，在含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的冰冷RIPA裂解液中充分研磨剪碎以制備組織勻漿，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度；進(jìn)行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取5 μl加樣，使用10%聚丙烯酰胺凝膠通過(guò)SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂牛奶或5%BSA封閉液封閉2 h，并使用對(duì)應(yīng)的抗體按說(shuō)明書(shū)推薦濃度比例在4℃過(guò)夜；用含0.1%TWEEN-20的TBST沖洗10 min (3次)，然后在室溫下與相應(yīng)的二抗(1∶5 000)孵育1 h，使用ECL發(fā)光液進(jìn)行可視化顯影，測(cè)得各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化后，比較心臟組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 2組心臟組織病理學(xué)變化比較 與對(duì)照組比較，PQ組大鼠在中毒后心肌出現(xiàn)明顯的病理變化，心肌纖維排列紊亂、腫脹，心肌細(xì)胞核腫脹或消失，染色變淡，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)

2.2 2組血清CK、LDH水平比較 與對(duì)照組比較，PQ組血清CK和LDH水平均升高(P均<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠血清心肌壞死標(biāo)志物CK和LDH水平比較

2.3 2組心臟組織SOD和MDA水平比較 PQ組大鼠心臟組織SOD水平較對(duì)照組降低，而MDA水平較對(duì)照組明顯上升(P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 2組大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷指標(biāo)SOD和MDA水平比較

2.4 2組心臟組織相關(guān)蛋白表達(dá)比較 PQ組大鼠心臟組織p-PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)和Bcl-2/Bax較對(duì)照組均顯著下降，而B(niǎo)ax、Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，見(jiàn)圖2、表3、表4。

圖2 各組大鼠心臟組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

表3 2組大鼠心臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白相對(duì)量表達(dá)比較

表4 2組大鼠心臟組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對(duì)量表達(dá)比較

3 討 論

目前，關(guān)于百草枯中毒導(dǎo)致心臟損傷及損傷相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制尚未闡明，但迄今認(rèn)為百草枯中毒誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激及相應(yīng)的級(jí)聯(lián)炎性反應(yīng)是導(dǎo)致多器官功能衰竭的重要原因。百草枯具有較強(qiáng)的氧化還原特性，在體內(nèi)經(jīng)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黃嘌呤氧化酶等的綜合作用下，產(chǎn)生大量的過(guò)氧化物陰離子，體內(nèi)ROS、氮類物質(zhì)增加，抗氧化酶系消耗，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增高，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，引起線粒體損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、DNA損害、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖及凋亡等[10-12]。PQ中毒后誘導(dǎo)心臟損傷并減弱心肌細(xì)胞的收縮功能，該毒性作用與ROS的增加有關(guān)，且伴隨氧化應(yīng)激、凋亡、鈣超載、炎性反應(yīng)、自噬等多種病理過(guò)程[13-14]。目前研究數(shù)據(jù)表明，百草枯急性暴露引起的心臟毒性損傷，表現(xiàn)為心臟組織結(jié)構(gòu)完整性破壞，心肌細(xì)胞壞死標(biāo)志物CK及LDH水平顯著升高。同時(shí)，PQ暴露破壞了心肌細(xì)胞氧化與抗氧化的平衡狀態(tài)，心肌抗氧化能力不足，表現(xiàn)為PQ組大鼠心臟組織中抗氧化物SOD活力水平較對(duì)照組明顯下降，而促氧化物MDA水平顯著增加。因此，氧化應(yīng)激參與了PQ導(dǎo)致的心臟毒性損傷過(guò)程，且心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的蓄積，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死，大量心肌細(xì)胞壞死和凋亡又進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度[14-15]。

細(xì)胞凋亡是各種生物體內(nèi)較常見(jiàn)的細(xì)胞死亡方式，在心血管疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如缺血/再灌注損傷、高血壓和糖尿病性心肌病等[16-17]。PI3K/AKT是一種廣泛的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，可參與機(jī)體多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[18]。該信號(hào)通路可被細(xì)胞內(nèi)外各種病理或應(yīng)激刺激而激活，如炎性反應(yīng)、缺血、缺氧和氧化應(yīng)激，多項(xiàng)研究表明，該信號(hào)通路對(duì)缺血再灌注和多種藥理介質(zhì)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)具有保護(hù)作用[19-21]。AKT是PI3K的關(guān)鍵下游介質(zhì)之一，活化的PI3K將膜結(jié)合的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP3作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使可結(jié)合并活化PI3K下游的信號(hào)蛋白AKT[22]。AKT作為強(qiáng)有力的Bad激酶，其活化后可使Bad位點(diǎn)磷酸化，磷酸化Bad(失活態(tài))使Bcl-2或Bcl-XL游離，發(fā)揮抗凋亡作用。同時(shí)，活化的AKT還可抑制Caspase-3的級(jí)聯(lián)活化，促進(jìn)細(xì)胞存活[23-26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性百草枯中毒顯著抑制了PI3K及AKT的磷酸化，從而顯著降低了抗凋亡蛋白Bcl-2水平，而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3水平則升高。結(jié)果與既往研究報(bào)道一致，PI3K/AKT通路作為控制心肌細(xì)胞存活和功能的重要促增殖及抗凋亡信號(hào)通路之一，在心肌細(xì)胞存活和程序性死亡的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[9]。

總之，百草枯中毒可以通過(guò)氧化還原反應(yīng)及誘發(fā)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)等一系列復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制該通路下游抗凋亡蛋白Bcl-2的分離和表達(dá)，促進(jìn)心臟組織的損傷和心肌細(xì)胞的凋亡。因此，PI3K/AKT介導(dǎo)的Bcl-2抗凋亡信號(hào)通路在百草枯中毒誘導(dǎo)心臟損傷的過(guò)程中發(fā)揮極其重要的生物學(xué)作用。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李玉華：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，資料收集整理，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文撰寫，論文修改；袁媛、王韞文：資料收集整理，論文修改；趙敏：提供研究方向、研究思路，研究選題，設(shè)計(jì)研究方案，修訂論文，論文終審