基因編輯技術(shù)在水稻遺傳改良中的應用進展

李萌 姜恭好 段海燕

摘 要 基因編輯是一種新興的比較精確的能對生物體基因組特定目標基因進行修飾的基因工程技術(shù)或過程。總結(jié)了近年基因編輯技術(shù)在提升水稻育種速度和效率、實現(xiàn)水稻的生長發(fā)育調(diào)節(jié)、載體構(gòu)建和突變體創(chuàng)制、水稻抗病目標改變、水稻品質(zhì)提升等遺傳改良方面的應用進展。簡要介紹了一代ZFNs基因編輯技術(shù)、二代TALENs基因編輯技術(shù)和三代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，重點介紹了CRISPR/Cas9的工作原理、優(yōu)缺點、類型和相關(guān)技術(shù)。最后對基因編輯技術(shù)在水稻遺傳改良方面的發(fā)展方向進行了展望。

關(guān)鍵詞 基因編輯;CRISPR/Cas9;水稻;遺傳改良;應用進展

中圖分類號：Q789 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.34.002

基因編輯，又稱基因組編輯或基因組工程，是一種新興的比較精確的能對生物體基因組特定目標基因進行修飾的基因工程技術(shù)或過程?；蚓庉嫾夹g(shù)通過插入和敲除基因、定點突變和堿基替換等對基因組靶位點進行一系列的人工修飾，以獲得新的功能或表型，甚至創(chuàng)造新的物種，在基因研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力，尤其是在植物遺傳改良和新品種培育方面應用十分廣泛。

1? 基因編輯技術(shù)在水稻遺傳改良中的應用進展

1.1? 提升水稻育種速度和效率

近年將基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組定點編輯技術(shù)不斷應用于水稻，用來深入研究水稻基因功能和精準培育水稻品種，而傳統(tǒng)基因組編輯技術(shù)只可對水稻基因片段隨機刪除或插入，精準插入效率不高。Yuming Lu等用硫代修飾和磷酸化修飾供體片段，成功提升敲入靶向的效率，對約1 400株植株進行編輯，成功效率平均值為25%，高者可達47%;此方法還能夠在4個位點進行靶向敲入，改進該方法得到重復片段介導的同源重組方法，能夠精準有效融合原位標簽蛋白并實現(xiàn)片段的替換，該效率約為11%[1]。覃玉芬等通過CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)編輯水稻品種GXU41中TMS5的兩個靶點位，獲得純合突變的T0代陽性植株，并在T1代獲得到無外源標記的植株[2]。由此證明該技術(shù)能夠提升獲得TGMS系的效率。Yusong Lv等同樣利用該技術(shù)基因編輯定點突變OsPAO5，實驗發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域存在天然SNP能夠介導水稻中胚軸性狀的馴化，在提升水稻出苗速率的同時，為后續(xù)耐直播水稻品種分子育種研究提供重要數(shù)據(jù)支撐[3]。

1.2? 實現(xiàn)水稻的生長發(fā)育調(diào)節(jié)

季新等根據(jù)CRISPR這項技術(shù)的基本原理，對水稻光敏色素互作因子OSPIL15的CRISPR表達載體進行構(gòu)建，創(chuàng)制OS0ZI5突變體并研究其對光信號調(diào)控的作用，將所獲得的10種OS0ZI5突變體與野生型進行對比，發(fā)現(xiàn)突變型的粒長明顯變長，株高明顯變矮，實驗表明該技術(shù)能夠證明光信號對其突變體生長發(fā)育的調(diào)控作用[4]。楊柳等通過該技術(shù)及反向遺傳學方法，針對OsMADS56基因設計特異性敲除靶位點，并構(gòu)建該基因敲除載體，運用農(nóng)桿菌介導法獲得野生粳稻9522背景的轉(zhuǎn)基因苗。實驗結(jié)果表明9株OsMADS56轉(zhuǎn)基因苗具有3種純合突變類型，對蛋白序列進行比對和分析，發(fā)現(xiàn)3種類型突變都能夠造成移碼突變和蛋白翻譯提前終止，引起保守結(jié)構(gòu)域的缺失。因此判斷水稻OsMADS56與擬南芥SOC1功能保守，能夠調(diào)控水稻的花發(fā)育及開花時間[5]。賈辰昊等設計1對sgRNA序列并運用自然降溫以獲得雙鏈sgRNA，并運用T4連接酶的作用與載體pHSN401相連，進行菌落PCR測序后，將成功構(gòu)建的CRISPR基因編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，獲得水稻OsSAUR23基因的基因編輯突變體材料。實驗結(jié)果表明CRISPR/Cas9技術(shù)作用下的OsSAUR23基因在生長素響應信號通路中扮演重要角色[6]。楊平等運用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻W(wǎng)x、Badh2基因進行編輯，從而獲得能夠穩(wěn)定遺傳且直鏈淀粉含量較低的突變體，使此類稻米更受青睞，同時這項實驗也為后續(xù)進一步開展稻米品質(zhì)研究提供參考依據(jù)[7]。

1.3? 實現(xiàn)載體構(gòu)建和突變體創(chuàng)制

陳強等首先將水稻的多胚基因OsPE運用基因編輯技術(shù)進行載體構(gòu)建，將模板OsU6a進行兩次PCR，成功構(gòu)建表達盒，通過T4連接酶將表達盒連接至載體中，通過PCR反應、酶切和測序后，得到pYLCRISPR/Cas9-gRNA的多胚基因載體，為深入研究多胚基因提供參考[8]。

王荃等研究發(fā)現(xiàn)DUFs蛋白對生物成長有很大作用，運用基因編輯技術(shù)構(gòu)建OsDUF393的載體，并通過農(nóng)桿菌介導的方法將待轉(zhuǎn)化品種中花11進行轉(zhuǎn)化，獲得T0代水稻植株100株，對其進行測序后發(fā)現(xiàn)確實存在堿基的變化，實驗創(chuàng)制了基因突變體，并表明通過基因編輯技術(shù)確實使得OsDUF393基因得到了定向編輯效果[9]。同樣運用該技術(shù)，惠索禎等將粳稻品種沈農(nóng)265作為赤霉素2氧化酶基因OsGA2oxlO進行基因編輯的遺傳背景，將獲得的突變體進行PCR后發(fā)現(xiàn)突變體基因的表達量相對于野生型表現(xiàn)出很明顯的下降趨勢。進一步分析發(fā)現(xiàn)基因在水稻幼穗部的表達程度相較于在葉鞘、根部、莖葉的表達程度不同。實驗明確了該基因的功能，表明基因編輯技術(shù)確實能夠調(diào)控GA2oxl0基因功能[10]。

為研究生長素對水稻生長的參與過程，王道洋等運用基因編輯技術(shù)對OsARF8靶點位進行設計并對其進行敲除。首先構(gòu)建載體，然后運用農(nóng)桿菌介導法對水稻品種9522進行轉(zhuǎn)入，隨后篩選得到28株轉(zhuǎn)基因植株，進一步對OsARF8鑒定得到6株在外顯子174的區(qū)域內(nèi)發(fā)生了堿基的缺失，而對堿基突變深入探究得到第7個氨基酸發(fā)生變化，進而使得亮氨酸變化成為色氨酸，由該處及以后的氨基酸序列均發(fā)生移碼的突變，發(fā)現(xiàn)在第123的氨基酸發(fā)生提前終止，由此證明此突變體中的DBD功能域無法全部表達，ARF8蛋白的功能也同時受到影響[11]。本實驗證明運用基因標記技術(shù)能夠?qū)⑺净騉sARF8敲除，為后續(xù)研究提供范本。陶英瑜等研究發(fā)現(xiàn)水稻種子的發(fā)芽率對直播影響較大，ABI5的含量下降會使種子萌發(fā)速度和效率更高。通過基因編輯技術(shù)對OsABI5突變體進行構(gòu)建，運用農(nóng)桿菌介導法將所構(gòu)建的OsABI5敲除質(zhì)粒導入愈傷組織，得到osabi5-2突變體，觀察后得出運用基因編輯技術(shù)確實能夠?qū)λ痉N子萌發(fā)加以調(diào)控[12]。

1.4? 實現(xiàn)水稻抗病目標改變

楊海河等使用CRISPR/Cas9技術(shù)為患稻瘟病水稻的Pi21基因進行針對性地定點突變，從而能夠得到抗稻瘟病的植株，在T0代即達到約87%的基因存在靶序列堿基的缺失?；疾≈晗蹬c抗病的株系在同樣接種病菌情況下，表現(xiàn)出突變植株的抗性更強[13]。該實驗結(jié)果成功獲得抗病植株，為開展稻瘟病研究提供數(shù)據(jù)支持。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)獲得具有廣譜抗病性的時間較長，而運用CRISPR技術(shù)能使水稻對抗白葉枯病的廣譜性得到提升。運用CRISPR技術(shù)長時期監(jiān)管水稻的白葉枯病獲得許多專家教授的肯定。在T2代中突變型的水稻品質(zhì)表現(xiàn)出蠟質(zhì)狀，并且直鏈淀粉含量呈大幅度降低，約降低為2%左右。實驗實現(xiàn)了白葉枯病的廣譜抗病性，也體現(xiàn)出運用CRISPR技術(shù)確實能夠在對Wx基因進行編輯后達到糯性品質(zhì)的改良效果。

1.5? 實現(xiàn)水稻品質(zhì)提升

隨著生活質(zhì)量的提高，人們對水稻口感等品質(zhì)方面的需求標準逐漸提升，香糯口感和長粒更符合市場需求。直鏈淀粉含量是一種研究判斷水稻稻米品質(zhì)的理化指標，而新的基因編輯技術(shù)使得快速高質(zhì)量達到該目標成為可能，能夠?qū)⒍喾N品質(zhì)性狀同時加以改良，將控制水稻口感粒長的直鏈淀粉含量調(diào)控到適合的程度。

周鑫等運用CRISPR技術(shù)對Wx基因進行分析以獲得優(yōu)質(zhì)糯稻，將靶點位分別設置在該基因的7、8、11、12、2和10外顯子的區(qū)域內(nèi)，用基因編輯技術(shù)對表達載體進行構(gòu)建，并運用農(nóng)桿菌介導法將設計好的載體導入至準備好的水稻品種中，獲得多株再生基因的植株。進一步分析表明，突變率整體走低，多數(shù)為小于30%，都位于2、11、7外顯子區(qū)域內(nèi)部，多數(shù)小于2 bp的缺失或者插入，并且大多是純合基因型或者是雙等位的突變[14]。該研究發(fā)現(xiàn)在糯稻的新品種培育時，應多培育突變體并篩選合適的靶點位，以期達到糯性水稻標準。

東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所實驗證明，對Wx基因的不同靶點位分別設計PBE-TS2、1、3載體，將其導入至目標水稻品種，突變型表現(xiàn)出其直鏈淀粉含量均有小幅度降低，TS2尤為明顯，下降幅度約為4%，且水稻收獲后保持為透明狀態(tài)[15]。同樣的方法，對黑龍江省內(nèi)水稻種植比例最大的品種進行基因編輯后發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉含量的下降幅度與前面實驗保持一致。

Yongjie Kuang等培育出能夠抑制雜草生長的水稻品種[16]。王海明等利用水稻基因NRR是調(diào)控根系生長的多效基因，同樣運用CRISPR技術(shù)進行基因敲除，發(fā)現(xiàn)被敲除后的植株根系鮮重比野生型的植株更重[17]。

2? 基因編輯技術(shù)研究進展

2.1? 前兩代基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)通過插入和敲除基因、定點突變和堿基替換等對基因組靶位點進行一系列的人工修飾，包括了先后發(fā)展的三代技術(shù)，分別為一代的ZFNs基因編輯技術(shù)、二代的TALENs基因編輯技術(shù)和三代的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。三者原理和方式存在差異，但同樣需要人工進行改造的序列特異性核酸內(nèi)切酶的支持，在相應的目標基因組位置進行DNA切割并引發(fā)雙鏈的斷裂。

ZFNs是基因編輯歷史上的第一代技術(shù)[18]，是多種蛋白質(zhì)中普遍存在的蛋白基序，通過介導蛋白質(zhì)、核酸、小分子及其他蛋白質(zhì)發(fā)揮特異相互作用。運用ZFNs技術(shù)能夠進行基因敲除或者將目標基因?qū)耄钄嗷虻募せ?，使基因序列得到改造。同時ZFNs存在一些不足之處，如ZFNs在每次對DNA片段進行剪切時無法充分依靠同源二聚體的形成，存在異源二聚體，極可能會造成脫靶效應，使得DNA序列發(fā)生改變或者出現(xiàn)錯配的情況，甚至產(chǎn)生較強細胞毒性和導致細胞凋亡。引外，ZFNs對DNA的特異性識別度較低，篩選出能夠成功構(gòu)建特異性且切割速度較高的ZFNs基因編輯技術(shù)無疑需要投入大量成本。

TALENs是基因編輯歷史上的第二代技術(shù)，由TAL效應因子的DBD及FokI核酸內(nèi)切酶的DNA切割出來的結(jié)構(gòu)域兩部分構(gòu)成。其中TALEN又由3部分構(gòu)成，分別為核定位信號的N端結(jié)構(gòu)域、能夠較為準確識別特定DNA序列的串聯(lián)TALE重復序列的中央結(jié)構(gòu)域及具有Fokl核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域。該項技術(shù)的優(yōu)點是TALENs的TAL效應物為串聯(lián)重復的識別堿基單元，較低的脫靶概率和較高的特異性、較為簡單的載體構(gòu)建方式和較低的成本，使得該技術(shù)更受青睞。

2.2? 第三代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

2.2.1? 技術(shù)原理

CRISPR/Cas是一種適應性的免疫系統(tǒng)。追溯發(fā)現(xiàn)其存在于古細菌和原核生物細菌中，通過自身進化來抵抗入侵DNA和病毒。該系統(tǒng)能夠?qū)ν庠碊NA進行識別、特異性切割，同時能夠沉默外源基因表達。該系統(tǒng)由CRISPR序列元件及Cas基因家族蛋白兩部分構(gòu)成。構(gòu)成CRISPR序列元件的是高度保守的重復序列、位于重復上游的引導序列及間隔序列相間排列。位于相同位點的重復序列高度保守，而具有較高多樣性的是位于不同位點間的重復序列。CRISPR位點附近存在著具有內(nèi)切酶活性和核酸酶的Cas基因家族蛋白酶，使得DNA系列特異性得以修復。

通過轉(zhuǎn)錄加工成的crRNA和反式激活tracrRNA共同形成雙元復合體結(jié)構(gòu)sgRNA，進而由sgRNA引導Cas9蛋白酶的HNH，與crRNA 堿基互補配對的模板鏈可以被特異性地識別并實現(xiàn)切割;RuvC作用于切割第二條鏈特定位點，并通過體內(nèi)NHEJ修復機制使得基因突變得以引入。對此我們可以進行不同sgRNA的設計，從而運用CRISPR/Cas9對不同的DNA堿基序列進行剪切獲得新的突變體。

2.2.2? 優(yōu)缺點

CRISPR/Cas9第三代基因編輯技術(shù)是新興的定點基因編輯工具。CRISPR/Cas9技術(shù)通過對內(nèi)源基因進行編輯從而完成作物的遺傳基因改良，利用短RNA和核酸酶對特定靶標基因進行突變，并對無外源基因整合的編輯材料進行篩選，在保證不會影響基因組的其他位點前提下，實現(xiàn)DNA修復系統(tǒng)對特定位點進行精確突變。CRISPR技術(shù)因使用簡便且效率更高的優(yōu)點，被廣泛應用于水稻和高粱等糧食作物的基因組編輯工作中，同時運用在對人類及動物細胞等多種生物進行定點修飾中，并且該技術(shù)能夠避免傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因所導致的安全問題。但CRISPR/Cas9技術(shù)存在小概率的脫靶現(xiàn)象，從而引起基因組非靶向位點的突變影響實驗結(jié)果。如何實現(xiàn)運用HDR修復途徑提高對基因編輯的效率、實現(xiàn)大片段插入和堿基替換仍需進一步研究。

2.2.3? 主要類型

目前已發(fā)現(xiàn)三種類型的10個亞種系統(tǒng)。Ⅰ型存在于古生菌的大腸桿菌等細菌和銅綠假單胞菌中，包含Cas2、Cas3、Cas5、Cas6、Cas7等亞型。Ⅱ型僅存于嗜熱鏈球菌等細菌基因組，包含Casl、Cas2、Cas9等亞型。Ⅲ型存在于激烈火球菌等古生菌，包含Casl、Cas2、Cas6等亞型。Ⅰ型和Ⅱ型的靶標類型均為DNA，Ⅲ型的靶標類型為DNA或RNA。

2.2.4? 相關(guān)技術(shù)

發(fā)展基因編輯技術(shù)，也需同時發(fā)展相應的檢測方式。焦磷酸測序是ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶及熒光素酶等4種酶參與化學反應的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，免除需要通過熒光標記的引物和電泳檢測的方法對已知的短序列采取測序分析的環(huán)節(jié)，該技術(shù)具有快速準確分析和實時檢測的優(yōu)點，能夠鑒別很多植物成分及其病原微生物，逐漸成為單核苷酸多態(tài)性進行基因分型和突變檢測的方式之一。解美霞等在檢測水稻PL3基因的靶向突變時采用CRISPR/Cas9技術(shù)進行誘導，實驗結(jié)果表明該技術(shù)能夠根據(jù)所檢測編輯的位點對編輯后的水稻及未被編輯的野生型水稻加以準確區(qū)分，與以往技術(shù)相比具有更高的效率和準確性，對水稻位點定性具有較廣闊的前景[19]。

基因編輯技術(shù)的持續(xù)快速發(fā)展為進一步開展植物基因功能研究及作物的遺傳改良奠定基礎。已發(fā)展技術(shù)如PCR法、電泳法和測序法具有操作較復雜、耗時較長和成本較高等系列問題，而PARMS技術(shù)則是通過熒光檢測的方式進行SNP的基因分型，具有前面幾種方法所不具備的優(yōu)點?；贏RMS技術(shù)開發(fā)的SNP基因分型技術(shù)PARMS，采用1對通用熒光引物、1對等位基因特異引物和1條反向共用引物共5種引物對SNP和短Indel位點進行等位基因的特異性擴增，并采用熒光掃描進行基因分型。律文堂等同樣利用該技術(shù)對水稻進行基因編輯，從而能夠?qū)χ仓赀M行基因分型，所得到的鑒定結(jié)果能夠與電泳法、測序法結(jié)果吻合，充分證明了該技術(shù)能夠?qū)λ具M行植株編輯及對其后代進行基因分型，同時為其他作物進行后代編輯提供良好范本[20]。

3? 展望

CRISPR/Cas9技術(shù)為基因組定向修飾帶來新突破，但該技術(shù)研究時間尚短，仍需深入探索。應引導我國從事水稻育種研發(fā)的種業(yè)公司和科研院所共同合作，引導CRISPR技術(shù)與常規(guī)育種方法結(jié)合，通過設計多gRNA靶向到單一基因，特異性的獲得多遺傳性狀的各種組合。目前該技術(shù)在水稻育種的應用依賴于HNEJ途徑基因敲除，但如何更好運用HDR實現(xiàn)大片段的插入和堿基替換依然有很大的可能性;并且該技術(shù)會有一定概率出現(xiàn)脫靶情況，引起基因組的非靶向位點的突變，造成研究結(jié)果不確定性。對未知領(lǐng)域應積極探索，目前各研究運用較為廣泛的Cas9蛋白基本都來自于Ⅱ型CRISPR技術(shù)，而Ⅰ和Ⅲ型仍有良好的發(fā)展?jié)摿?。同時，應注意運用該技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植株是否符合法律規(guī)定，不斷提高無外源基因的水稻基因的效率和準確性，對可能出現(xiàn)的不良情況加以預測并及時干預。

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（責任編輯：易? 婧）

收稿日期：2021-08-12

作者簡介：李萌（1996—），女，河北承德人，黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院資源利用與植物保護專業(yè)2020級在讀碩士研究生，主要從事作物分子育種研究。E-mail： 572023305@qq.com。

*為通信作者，E-mail： 1144983024@qq.com。