過表達(dá)microRNA-224骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠坐骨神經(jīng)損傷的作用及其機(jī)制研究*

胡安全，王正安，秦力，李哲，馮祁軍

（嘉興市第一醫(yī)院 骨科，浙江 嘉興314000）

坐骨神經(jīng)損傷是一類臨床上常見的神經(jīng)損傷疾病，常與髖關(guān)節(jié)脫位、髖臼骨折等外傷并存，以車禍、工傷較為常見[1-2]。坐骨神經(jīng)損傷恢復(fù)較慢，若治療不當(dāng)，可引起肢體癱瘓，造成患者嚴(yán)重殘疾。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC）是一類源自骨髓基質(zhì)的成體干細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能[3-4]。大量研究表明，BMMSC能夠誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，對坐骨神經(jīng)損傷具有一定的修復(fù)作用[4-5]。然而，絕大部分BMMSC在移植后迅速凋亡，不能充分發(fā)揮其修復(fù)功能。目前，提高BMMSC的治療潛能是基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)問題。

MicroRNA（miRNA）是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)的非編碼RNA，具有多種生物學(xué)功能，在坐骨神經(jīng)損傷的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。既往研究表明，轉(zhuǎn)染microRNA-224（miR-224）可以提高移植后BMMSC 的存活能力，增強(qiáng)BMMSC 治療卵巢早衰的效果[7]。然而，尚不清楚miR-224 轉(zhuǎn)染能否增強(qiáng)BMMSC 對坐骨神經(jīng)損傷的治療作用。因此，本實(shí)驗(yàn)將過表達(dá)miR-224 的BMMSC 移植至大鼠坐骨神經(jīng)，評估m(xù)iR-224 聯(lián)合BMMSC 對坐骨神經(jīng)損傷的治療作用，并探索相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料

8～9 周齡SPF 級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠購自北京華阜康生物技術(shù)有限公司。miR-224 慢病毒載體由山東維真生物科技有限公司構(gòu)建，并進(jìn)行鑒定。間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和DEME 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，CD29、CD34、CD45 和CD90 抗體購自美國R&D 公司，凋亡檢測試劑盒購自德國Roche公司，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、髓鞘堿性蛋白（myelinbasicprotein,MBP）、生長相關(guān)蛋白-43（growth associated protein,GAP-43）和甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗體購自美國Abcam 公司。

1.2 BMMSC的分離、培養(yǎng)、鑒定及轉(zhuǎn)染

將SD 大鼠麻醉后置于無菌冷凍臺上，快速分離股骨和脛骨，剪開兩端骨髓后收集骨髓，制備成單細(xì)胞懸液。加入Percoll 分離液，離心后收集中間層的單個核細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞接種在間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，利用流式細(xì)胞儀檢測BMMSC表面CD29、CD34、CD45和CD90的表達(dá)，可見CD29和CD44高表達(dá)，CD34和CD45低表達(dá)。將BMMSC分為3 組：BMMSC 組（坐骨神經(jīng)損傷+BMMSC）、LVBMMSC 組（坐骨神經(jīng)損傷+LV-BMMSC） 和miR-224-BMMSC 組（坐骨神經(jīng)損傷+miR-224-BMMSC），其中，BMMSC 組不給予任何處理，LV-BMMSC 組加入慢病毒空載體液，轉(zhuǎn)染48 h；而miR-224-BMMSC組加入miR-224 慢病毒載體液，轉(zhuǎn)染48 h。每個實(shí)驗(yàn)設(shè)置5 個復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.3 qRT-PCR檢測miR-224轉(zhuǎn)染情況

轉(zhuǎn)染48 h 后，提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNAs 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并配置PCR 反應(yīng)體系。采用qRT-PCR，以U6 作為內(nèi)參，檢測miR-224 的轉(zhuǎn)染情況。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性15 s，55℃退火10 s，72℃延伸20 s，共計(jì)40 個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-224 相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 模型的復(fù)制與分組

將SD 大鼠隨機(jī)分為5 組：假手術(shù)組、模型組、BMMSC組（坐骨神經(jīng)損傷+BMMSC）、LV-BMMSC組（坐骨神經(jīng)損傷+LV-BMMSC）和miR-224-BMMSC 組（坐骨神經(jīng)損傷+miR-224-BMMSC），每組各15只。后4組均利用鉗夾法復(fù)制坐骨神經(jīng)損傷模型，具體操作步驟如下：將SD大鼠麻醉后固定在鼠板上，分離皮膚和肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，利用血管夾鉗夾坐骨神經(jīng)，10 s后松開，反復(fù)鉗夾3次。以顯微鏡下可見神經(jīng)軸突中斷、外膜連續(xù)為模型復(fù)制成功。而假手術(shù)組除不鉗夾坐骨神經(jīng)外，其余步驟同上。模型復(fù)制完成后，BMMSC組在神經(jīng)損傷處注射1.5×106個BMMSC，LVBMMSC 組在神經(jīng)損傷處注射1.5×106個LV-BMMSC，miR-224-BMMSC 組在神經(jīng)損傷處注射1.5×106個miR-224-BMMSC。

1.5 BBB運(yùn)動評分量表評估運(yùn)動功能

分別在手術(shù)當(dāng)天、術(shù)后第12 天和第24 天評估各組大鼠的運(yùn)動功能。BBB運(yùn)動評分量表范圍為0～24 分，分?jǐn)?shù)越高，表示運(yùn)動功能越好。

1.6 坐骨神經(jīng)功能測定

制作一個10 cm×10 cm 的足印行走盒，將所有大鼠的雙足蘸滿墨水，放在盒中，使其自由行走。分別在手術(shù)當(dāng)天、術(shù)后第12 天和第24 天檢測足趾寬度、足印長度和寬度，計(jì)算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic functional index,SFI）。其中，SFI=0 為正常，SFI=100 為坐骨神經(jīng)完全損傷。

1.7 Western blotting

術(shù)后第24 天麻醉大鼠，切除坐骨神經(jīng)，PBS 清洗后提取總蛋白。利用SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，TBST 洗滌3 次。封閉后將PVDF 膜置于一抗孵育盒中，4℃避光孵育。一抗孵育后向孵育盒中加入HRP 標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。利用凝膠成像儀對PVDF 膜進(jìn)行灰度值掃描，以GAPDH為內(nèi)參，檢測BDNF、MBP和GAP-43蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

術(shù)后第24 天麻醉大鼠，切除坐骨神經(jīng)，制成組織勻漿。離心后棄上清，加入70%乙醇固定，PBS 清洗3 次。依次加入Annexin V-FITC 和PI 染色液，混勻后避光孵育10 min，置于流式細(xì)胞儀上檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-224轉(zhuǎn)染情況

BMMSC組、LV-BMMSC組、miR-224-BMMSC組BMMSC 細(xì)胞miR-224相對表達(dá)量分別為（1.00±0.24）、（1.07±0.19）和（5.34±0.29），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=625.517，P=0.000）；miR-224-BMMSC組高于BMMSC組和LV-BMMSC組（P＜0.05）。

2.2 運(yùn)動功能評估

假手術(shù)組、模型組、BMMSC 組、LV-BMMSC組、miR-224-BMMSC 組大鼠術(shù)后第12 天和第24 天BBB 評分比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)大鼠的BBB 評分有差異（F=139.685，P=0.000）；②各組大鼠的BBB 評分有差異（F=105.341，P=0.000），術(shù)后第12天和第24天，模型組低于假手術(shù)組（P＜0.05），BMMSC 組高于模型組（P＜0.05），miR-224-BMMSC 組高于BMMSC 組（P＜0.05）；③各組大鼠的BBB評分變化趨勢有差異（F=43.627，P=0.000）。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)的BBB評分比較（n=15，±s）

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)的BBB評分比較（n=15，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與BMMSC組比較，P ＜0.05。

術(shù)后第24天組別手術(shù)當(dāng)天術(shù)后第12天20.92±0.26 8.32±0.84①15.15±0.93②15.37±0.76②18.75±0.96②③假手術(shù)組模型組BMMSC組LV-BMMSC組miR-224-BMMSC組20.87±0.23-- - -20.94±0.15 5.21±0.51①10.87±0.66②10.22±0.59②14.64±0.71②③

2.3 坐骨神經(jīng)功能比較

假手術(shù)組、模型組、BMMSC 組、LV-BMMSC組、miR-224-BMMSC組大鼠手術(shù)當(dāng)天、術(shù)后第12天和第24 天測量的SFI 比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)大鼠的SFI有差異（F=86.427，P=0.000）；②各組大鼠的SFI 有差異（F=43.646，P=0.000），術(shù)后第12 天和第24 天，模型組高于假手術(shù)組（P＜0.05），BMMSC 組低于模型組（P＜0.05），miR-224-BMMSC 組低于BMMSC 組（P＜0.05）；③各組大鼠的SFI 變化趨勢有差異（F=23.595，P=0.000）。見表3。

表3 各組大鼠不同時間點(diǎn)SFI比較 （n=15，±s）

表3 各組大鼠不同時間點(diǎn)SFI比較 （n=15，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與BMMSC 組比較，P ＜0.05。

組別手術(shù)當(dāng)天術(shù)后第12天術(shù)后第24天假手術(shù)組模型組BMMSC組LV-BMMSC組miR-224-BMMSC組0.69±0.04 20.49±1.21①19.65±0.84 20.74±1.04 21.26±0.95 0.64±0.05 16.21±0.41①10.66±0.56②10.22±0.59②6.25±0.42②③0.72±0.04 14.56±0.44①5.14±0.37②5.39±0.32②1.21±0.12②③

2.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)組織蛋白相對表達(dá)量比較

各組大鼠坐骨神經(jīng)組織BDNF、MAP和GAP-43蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；miR-224-BMMSC組高于模型組、BMMSC組和LV-BMMSC組（P＜0.05）。見表4和圖1、2。

表4 各組大鼠BDNF、MAP、GAP-43蛋白相對表達(dá)量比較 （n=15，±s）

表4 各組大鼠BDNF、MAP、GAP-43蛋白相對表達(dá)量比較 （n=15，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與BMMSC 組比較，P ＜0.05。

GAP-43組別BDNF MAP 1.00±0.13 1.75±0.16①2.67±0.19②2.73±0.22②3.67±0.24②③141.279 0.000假手術(shù)組模型組BMMSC組LV-BMMSC組miR-224-BMMSC組F 值P 值1.00±0.14 1.46±0.17①2.13±0.19②2.03±0.18②2.83±0.21②③75.183 0.000 1.00±0.12 1.64±0.15①2.34±0.17②2.45±0.19②3.05±0.22②③104.125 0.000

圖1 各組大鼠BDNF、MAP、GAP-43蛋白的表達(dá)

2.5 凋亡結(jié)果比較

假手術(shù)組、模型組、BMMSC組、LV-BMMSC組、miR-224-BMMSC 組大鼠BMMSC 凋亡率分別為（2.02±0.23）%、（19.47±1.69）%、（10.31±1.23）%、（10.92±1.05）%和（4.68±0.47）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=197.246，P=0.000）；miR-224-BMMSC 組低于模型組、BMMSC 組 和LV-BMMSC 組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠BMMSC流式細(xì)胞圖

3 討論

近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，交通事故傷日漸增多，坐骨神經(jīng)損傷的發(fā)生率也逐漸增高。坐骨神經(jīng)損傷恢復(fù)較慢，若治療不當(dāng)，可引起肢體癱瘓，造成嚴(yán)重殘疾[8-9]。神經(jīng)鉗夾是一種經(jīng)典的坐骨神經(jīng)損傷模型，利用鉗夾造成坐骨神經(jīng)的軸突斷裂，但神經(jīng)外膜的連續(xù)性不受破壞[8]。本研究利用血管夾鉗夾坐骨神經(jīng)，誘導(dǎo)大鼠坐骨神經(jīng)損傷。模型組大鼠手術(shù)當(dāng)天出現(xiàn)下肢癱瘓，運(yùn)動功能喪失，BBB 評分為0 分，SFI 也顯著升高。這些結(jié)果表明，本研究成功復(fù)制大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，為下一步研究奠定了基礎(chǔ)。

BMMSC 具有多向分化潛能，可在損傷部位分化為特定的細(xì)胞類型，通過重建組織微環(huán)境，增加細(xì)胞功能，參與組織的修復(fù)過程[10-11]。研究表明，BMMSC 能夠誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，修復(fù)損傷的坐骨神經(jīng)，部分改善神經(jīng)功能，但不能完全修復(fù)損傷的坐骨神經(jīng)[12]。進(jìn)一步研究證實(shí)，移植后BMMSC 快速凋亡是影響其療效的主要原因之一。絕大部分BMMSC 在移植后4 d 內(nèi)快速凋亡，移植后存活率僅為10%～20%[13-14]。因此，提高BMMSC 移植后存活率，降低其凋亡可有效提高BMMSC 的療效。

miR-224 是新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA，通過調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[15]。王家云等[16]的研究表明，miR-224 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡作用，是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞發(fā)揮凋亡抗性的重要驅(qū)動因素。蔣來等[7]的研究也證實(shí)，過表達(dá)miR-224 可以提高BMMSC 移植后的存活能力，進(jìn)一步改善BMMSC 移植對卵巢早衰的治療作用。因此，筆者將miR-224 的抗凋亡作用與BMMSC的修復(fù)效應(yīng)相結(jié)合，通過將過表達(dá)miR-224的BMMSC 移植回?fù)p傷部位，探究其對坐骨神經(jīng)損傷的治療作用。

BBB 評分和SFI 是常用的坐骨神經(jīng)功能評估指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，將過表達(dá)miR-224 的BMMSC移植回受損的坐骨神經(jīng)，與BMMSC 或LV-BMMSC移植比較，miR-224-BMMSC 組大鼠BBB 評分明顯升高，SFI 降低，提示過表達(dá)miR-224 的BMMSC 可進(jìn)一步促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)，改善運(yùn)動功能。此外，miR-224-BMMSC 移植可上調(diào)BDNF、MAP 和GAP-43 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)坐骨神經(jīng)的再生與修復(fù)。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果也表明，miR-224 轉(zhuǎn)染可顯著提高移植后BMMSC 在體內(nèi)的存活率，修復(fù)損傷的坐骨神經(jīng)。上述結(jié)果表明，miR-224 聯(lián)合BMMSC 具有更強(qiáng)大的神經(jīng)修復(fù)效果。

綜上所述，與單一BMMSC 移植相比，過表達(dá)miR-224 的BMMSC 具有更強(qiáng)大的神經(jīng)修復(fù)作用，可進(jìn)一步改善鉗夾傷引起的坐骨神經(jīng)損傷。本研究為臨床防治坐骨神經(jīng)損傷提供了新的思路和理論依據(jù)。但過表達(dá)miR-224 的BMMSC 能否通過其他機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用，以及如何將過表達(dá)miR-224的BMMSC 應(yīng)用于坐骨神經(jīng)損傷患者的臨床治療，仍需進(jìn)一步深入研究。