MicroRNA-335-5p對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的影響*

姜煒，沈曄，龍小琴

（湖州市第三人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.風(fēng)濕免疫科，浙江 湖州313000）

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種常見(jiàn)的炎癥性疾病，影響全球超過(guò)1%的人口，主要表現(xiàn)為炎癥、滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨及骨損傷，若不及時(shí)治療，40%～70%患者最終會(huì)發(fā)展為殘疾[1-2]。病程較長(zhǎng)的患者除累及關(guān)節(jié)外，還可并發(fā)肺間質(zhì)性疾病、心血管疾病等[3-4]，這將大大增加患者的疾病負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，因此應(yīng)盡早診斷和充分治療[5]。近年來(lái)，microRNAs（miRNAs）在RA 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用的報(bào)道越來(lái)越多[6-7]。miRNA 與靶向mRNA的3'-非編碼區(qū)（3'-untranslated region, 3'-UTR）結(jié)合，通過(guò)負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，導(dǎo)致mRNA 降解或相應(yīng)蛋白下調(diào)。XU 等[6]報(bào)道m(xù)iR-650 可以通過(guò)靶向Akt2，抑制類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs）的增殖、遷移和侵襲。最近一項(xiàng)研究結(jié)果表明，miR-126 通過(guò)PI3K-Akt 信號(hào)通路，影響RASFs 增殖和凋亡[7]。DKK1 是一種Wnt 信號(hào)通路抑制劑，被認(rèn)為是關(guān)節(jié)重塑的主要調(diào)節(jié)因子[8]。據(jù)報(bào)道，RA 患者病情嚴(yán)重程度與血清DKK1水平呈正相關(guān)[9]。RA 患者血清DKK1 水平較高，進(jìn)一步破壞關(guān)節(jié)，提示DKK1 在RA 發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[10]。本研究通過(guò)分析miR-335-5p 在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用，探討其與DKK1 的作用機(jī)制，為RA 的治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2018年3月—2019年3月在湖州市第三人民醫(yī)院實(shí)施關(guān)節(jié)手術(shù)的50 例RA 患者的滑膜組織標(biāo)本（RA組）。其中，男性32例，女性18例；年齡35～68歲，平均（50.3±7.5）歲。所有患者符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)疾病分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[11]。選取同期本院行關(guān)節(jié)置換手術(shù)的關(guān)節(jié)外傷患者50 例，取其滑膜組織標(biāo)本（對(duì)照組）。其中，男性26例，女性24例；年齡33～65歲，平均（48.5±6.4）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾?。粋魅静『桶┌Y；嚴(yán)重心、肝、腎損傷等系統(tǒng)性疾病；合并感染、免疫類(lèi)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基宣言》的指導(dǎo)方針和原則。所有參與者簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

采集的滑膜組織在37℃條件下，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化2 h。將消化后的滑膜組織離心得到RASFs。RASFs 置于改良后的DMEM 培養(yǎng)基中，輔以10%胎牛血清、100 u/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，將融合度為75%的細(xì)胞接種于6 孔板中培養(yǎng)。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑改良后的DMEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司），10% 胎牛血清（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）， Cell Proliferation ELISA, BrdU 試劑盒（美國(guó)Roche Applied Science），microRNA 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems 公司），Annexin V-FITC/PI 試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司），基質(zhì)凝膠（美國(guó)BD Biosciences 公司），RIPA 裂解緩沖液和BCA 蛋白分析試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），蛋白酶抑制劑（上海羅氏制藥有限公司），熒光素酶檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega 公司），miR-335-5p模擬物（miR-335-5p）、miR-335-5p 陰性對(duì)照（miR-NC）、DKK1 siRNA （si-DKK1，5'-TGATAGCCCTGTACAATGCTGCT-3'）、siRNA陰性對(duì)照（si-NC）、miR-335-5p 模擬物和pcDNA 載體（miR-335-5p+pcDNA）、 miR-335-5p 模 擬 物 和pcDNA-DKK1（miR-335-5p+pcDNA-DKK1）均購(gòu)自上?；蛑扑幱邢薰?。

1.3.2 主要儀器RNA 逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），ABI PRISM 7500 序列檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)ABI 公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司），F(xiàn)usion FX5 圖像分析系統(tǒng)（法國(guó)Vilber 公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將DKK1 cDNA 插入pcDNA3.1 載體生成DKK1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。 參照Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況將細(xì)胞分為miR-335-5p 組（將miR-335-5p模擬物轉(zhuǎn)染到RASFs 細(xì)胞系中）、miR-NC 組（將miR-335-5p 陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到RASFs 細(xì)胞系中）、si-DKK1 組（將DKK1 siRNA 轉(zhuǎn)染到RASFs 細(xì)胞系中）、si-NC 組（將siRNA 陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到RASFs 細(xì)胞系中）、miR-335-5p+pcDNA組（將miR-335-5p模擬物和pcDNA 載體轉(zhuǎn)染到RASFs 細(xì)胞系中）、miR-335-5p+pcDNA-DKK1組（將miR-335-5p和DKK1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到RASFs 細(xì)胞系中）。具體步驟如下：①轉(zhuǎn)染前1 天，將RASFs 細(xì)胞按1×106個(gè)/孔的密度接種于6 孔板；②轉(zhuǎn)染當(dāng)天將Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑與opti-MEM 培養(yǎng)液及合成的miR-335-5p 模擬物、miR-NC 或si-DKK1 均勻混合，室溫孵育5～10 min 后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中；③轉(zhuǎn)染48 h 后，胰酶消化細(xì)胞，PBS沖洗1次，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 ELISA 比色法采用ELISA 比色法檢測(cè)miR-335-5p 模擬物和si-DKK1 對(duì)RASFs 細(xì)胞增殖的影響。按照Cell Proliferation ELISA, BrdU 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。將RASFs 細(xì)胞按5×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。去除培養(yǎng)基，在37℃條件下用miR-335-5p 模擬物或si-DKK1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，再用BrdU 標(biāo)記液處理16 h。隨后去除培養(yǎng)基，固定細(xì)胞，變性。細(xì)胞在抗BrdU-POD 溶液中孵育90 min，洗滌3 次去除抗體偶聯(lián)物。TMB 底物孵育15 min 后，在405 nm 和490 nm 的吸光度下測(cè)定免疫復(fù)合物的OD 值。

1.4.3 RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）參照Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，從細(xì)胞系和臨床樣本中提取總RNA。采用260 nm 和280 nm的紫外吸收光譜（A260/280）檢測(cè)RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA 逆向轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用ABI PRISM 7500 序列檢測(cè)系統(tǒng)和microRNA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-335-5p 水平。擴(kuò)增體系：2 μl cDNA、0.4 μl 正向引物、0.4 μl反向引物、7.2 μl H2O2和10 μl SYBR。擴(kuò)增條件：25℃、10 min，48℃、30 min，95℃、5 min，U6 作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。采用SYBR?Green熒光染色檢測(cè)DKK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，GAPDH 作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)使用Annexin V-FITC/PI 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。將RASFs 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，PBS 洗滌2 次，重懸于緩沖液中。取5×105～10×105個(gè)重懸的細(xì)胞，200 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量，以區(qū)分凋亡細(xì)胞（Annexin V 陽(yáng)性和PI 陰性）和壞死細(xì)胞（Annexin V 陽(yáng)性和PI 陽(yáng)性）。

1.4.5 Transwell 法采用預(yù)先涂有包含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基質(zhì)凝膠Transwell 室（孔徑8 mm）進(jìn)行Transwell 基質(zhì)凝膠侵襲實(shí)驗(yàn)，以確定細(xì)胞的侵襲性。常規(guī)胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。取200 μl 細(xì)胞懸液加入Transwell 上室，并將600 μl含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基加入下室。在37℃、5%CO2環(huán)境下孵育6 h。取出小室，PBS 洗滌2 次，用棉簽將上室細(xì)胞擦去，將穿透的細(xì)胞固定在甲醇中，0.1%結(jié)晶紫染色，30%冰醋酸漂洗細(xì)胞膜，最后在540 nm 處檢測(cè)洗滌液，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 Western blotting將RASFs 細(xì)胞用冷的PBS洗滌2 次，然后用RIPA 裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白。采用BCA 蛋白分析試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。取50 μg 總蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，在37℃條件下用5% 脫脂乳封閉1 h，加入一抗DKK1 （1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4℃條件下孵育過(guò)夜，TBS 洗滌PVDF 膜3 次，10 min/次。加入羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，TBS 洗滌3 次，10 min/次。采用Fusion FX5 圖像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)將RASFs 細(xì)胞接種于24 孔板中，轉(zhuǎn)染前孵育24 h，待細(xì)胞融合達(dá)60%時(shí)，將miR-335-5p 模擬物和miR-NC 分別與DDK1 3'-UTR 野生型或突變型重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，參照熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用Renillaluciferase 報(bào)告基因檢測(cè)熒光素酶活性。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DKK1 mRNA 在滑膜組織和RASFs 中的表達(dá)

qRT-PCR 反應(yīng)結(jié)果顯示，RA 組、對(duì)照組患者滑膜組織中DKK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（4.82±0.30）和（1.21±0.11），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=61.881，P=0.000），RA 組高于對(duì)照組。此外，在RASFs 細(xì)胞系中，RA 組、對(duì)照組患者DKK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（6.51±0.42）和（1.50±0.13），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=62.414，P=0.000），RA 組高于對(duì)照組。

2.2 敲除DKK1 對(duì)RASFs 細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

qRT-PCR 和Western blotting 檢測(cè)結(jié)果表明，si-DKK1 組、si-NC 組DKK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.37±0.03）和（1.12±0.15），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.263，P=0.000），si-DKK1 組低于si-NC 組。si-DKK1 組、si-NC 組DKK1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.41±0.04）和（1.01±0.10），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=40.281，P=0.000），si-DKK1 組低于si-NC 組。

ELISA 比色法結(jié)果顯示，si-DKK1 組、si-NC 組RASFs 細(xì)胞增殖能力（OD 值）分別為（0.51±0.05）和（1.55±0.16），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.873，P=0.000），si-DKK1 組低于si-NC 組。體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-DKK1 組、si-NC 組RASFs 細(xì)胞侵襲能力（OD值）分別為（1.01±0.12）和（2.52±0.22），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.474，P=0.000），si-DKK1 組低于si-NC 組。

si-DKK1 組與si-NC 組RASFs 細(xì)胞促凋亡蛋白（Bax、FAS、BIM、Cleaved Caspase-3）和細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05），si-DKK1 組高于si-NC 組。見(jiàn)表2和圖1、2。

表2 兩組RASFs促凋亡蛋白和細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

表2 兩組RASFs促凋亡蛋白和細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

組別Bax FAS DKK1組NC組值1.12±0.11 0.34±0.03 15.297 1.03±0.10 0.36±0.04 13.910 BIM Cleaved Caspase-3細(xì)胞凋亡率/%sisit P 值0.0000.000 1.15±0.20 0.41±0.04 8.113 0.000 1.11±0.13 0.32±0.03 13.240 0.000 30.24±0.31 10.25±0.16 128.130 0.000?

圖1 促凋亡蛋白在RASFs中的表達(dá)

2.3 DKK1是miR-335-5p的直接作用靶基因

qRT-PCR 反應(yīng)結(jié)果顯示，RA 組、對(duì)照組患者滑膜組織中miR-335-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.50±0.05）和（1.00±0.10），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.970，P=0.000），RA 組低于對(duì)照組。RA組、對(duì)照組患者RASFs 中miR-335-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.25±0.03）和（1.01±0.11），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=40.281，P=0.000），RA 組低于對(duì)照組。

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，DKK1基因的3'-UTR 包含了一個(gè)miR-335-5p 靶序列（見(jiàn)圖3）。在RASFs細(xì)胞系中，miR-335-5p 組與miR-NC 組熒光素酶活性比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p 組低于miR-NC 組（見(jiàn)表3）。

qRT-PCR 和Western blotting 檢測(cè)結(jié)果表明，miR-335-5p組與miR-NC 組DKK1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p組低于miR-NC組。見(jiàn)表3和圖4。

圖2 敲除DKK1對(duì)RASFs凋亡的影響

圖3 3'-UTR的miR-335-5p靶序列

表3 兩組RASFs熒光素酶活性和DKK1相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 兩組RASFs熒光素酶活性和DKK1相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別熒光素酶活性DKK1 mRNA DKK1蛋白miR-335-5p組miR-NC組t 值P 值0.41±0.05 0.94±0.10 25.965 0.000 0.42±0.05 1.02±0.11 27.198 0.000 0.51±0.05 1.12±0.13 23.988 0.000

圖4 兩組RASFs的DKK1表達(dá)

2.4 過(guò)表達(dá)miR-335-5p 對(duì)RASFs 增殖、侵襲和凋亡的影響

在RASFs 中，miR-335-5p 組與miR-NC 組miR-335-5p 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p 組高于miR-NC 組。ELISA 比色法結(jié)果顯示，miR-335-5p 組與miR-NC組RASFs 增殖能力比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p組低于miR-NC 組。Transwell 法結(jié)果表明，miR-335-5p 組 與miR-NC 組RASFs 細(xì)胞侵襲能力比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p 組低于miR-NC 組。miR-335-5p 組與miR-NC 組RASFs 凋亡率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p組高于miR-NC 組。見(jiàn)表4和圖5。

表4 兩組RASFs細(xì)胞miR-335-5p及細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡情況比較 （±s）

表4 兩組RASFs細(xì)胞miR-335-5p及細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡情況比較 （±s）

組別增殖能力侵襲能力miR-335-5p細(xì)胞凋亡率/%miR-335-5p組miR-NC組t 值P 值12.15±1.15 1.00±0.10 62.675 0.000 0.53±0.04 1.80±0.20 34.105 0.000 1.01±0.10 2.52±0.12 27.198 0.000 31.02±2.15 10.11±1.12 23.988 0.000

圖5 過(guò)表達(dá)miR-335-5p對(duì)RASFs凋亡的影響

2.5 上調(diào)DKK1 減弱miR-335-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)RASFs的影響

為證實(shí)miR-335-5p 是否通過(guò)直接下調(diào)DKK1 影響RASFs，將miR-335-5p 模擬物和pcDNA-DKK1共轉(zhuǎn)染RASFs。miR-335-5p+pcDNA 組與miR-335-5p+pcDNA-DKK1 組DKK1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p+pcDNA 組較低（見(jiàn)表5和圖6）。ELISA比色法結(jié)果顯示，miR-335-5p+pcDNA 組與miR-335-5p+pcDNA-DKK1 組RASFs 增殖能力比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p+pcDNA 組增殖能力較低。Transwell 法結(jié)果表明，miR-335-5p+pcDNA 組與miR-335-5p+pcDNADKK1 組RASFs 細(xì)胞侵襲能力比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）， miR-335-5p+pcDNA 組侵襲能力較低。miR-335-5p+pcDNA 組與miR-335-5p+pcDNA-DKK1 組細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-335-5p+pcDNA 組細(xì)胞凋亡率較高（見(jiàn)表5和圖7）。

表5 兩組RASFs的DKK1及細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡情況比較 （±s）

表5 兩組RASFs的DKK1及細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡情況比較 （±s）

組別DKK1 mRNA DKK1蛋白增殖能力侵襲能力細(xì)胞凋亡率/%miR-335-5p+pcDNA組miR-335-5p+pcDNA-DKK1組t 值P 值1.00±0.11 2.25±0.24 25.933 0.000 0.51±0.05 1.12±0.13 23.988 0.000 0.70±0.08 1.80±0.10 47.047 0.000 0.91±0.09 2.11±0.10 48.854 0.000 30.12±3.05 10.03±1.14 33.794 0.000

圖6 兩組RASFs中的DKK1表達(dá)

圖7 上調(diào)DKK1減弱miR-335-5p過(guò)表達(dá)對(duì)RASFs的影響

3 討論

RA 是一種病因不明的自身免疫性疾病，其特征在于慢性炎癥和免疫細(xì)胞的滑膜浸潤(rùn)，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未完全了解。RA 的初始階段與先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)改變相關(guān)，從而產(chǎn)生針對(duì)各種分子的自身抗體。RA 發(fā)病機(jī)制中涉及的關(guān)鍵細(xì)胞、介質(zhì)及機(jī)制的研究可以為開(kāi)發(fā)新的、精準(zhǔn)治療疾病的抗風(fēng)濕藥提供依據(jù)[12]。既往研究報(bào)道，DKK1 通過(guò)促進(jìn)RANKL 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，直接影響成骨細(xì)胞分化，間接促進(jìn)骨破壞[8]。在RA 模型中，DKK1 在RASFs 體外表達(dá)，受到糖皮質(zhì)激素代謝的嚴(yán)格調(diào)控，并支持Wnt 信號(hào)抑制其在RA 骨破壞中的作用[13]。JUAREZ 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在RA 早期檢測(cè)到DKK1 差異表達(dá)，提示DKK1 表達(dá)增加可能是RA 進(jìn)展的關(guān)鍵事件，并發(fā)生在疾病早期。DKK1抑制Wnt 信號(hào)可能是早期RA 患者RASFs 影響骨破壞的一個(gè)途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，DKK1 在RA 組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高。沉默DKK1 可以抑制RASFs 的增殖和侵襲，并促進(jìn)RASFs 的凋亡?？梢?jiàn)，DKK1 在RA 發(fā)病機(jī)制中扮演重要作用。

研究表明，miRNAs 在多個(gè)生物過(guò)程中發(fā)揮多功能作用，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移、炎癥，以及異常先天免疫反應(yīng)期間的侵襲，使其成為治療眾多自身免疫性疾病的潛在靶點(diǎn)[15-16]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs 與RA 的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[17]。既往報(bào)道表明，RA 患者RASFs 中miR-522、miR-338-5p、miR-29a 等的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生改變，提示其在RA 發(fā)病機(jī)制中起到RA 激動(dòng)劑或抑制因子的作用[18-20]。TSENG 等[21]采用下一代測(cè)序技術(shù)分析RASFs 中轉(zhuǎn)錄組與miRNA 的差異表達(dá)譜，鑒定出眾多miRNA 異常表達(dá)，其中miR-335-5p 相對(duì)表達(dá)量顯著降低。因此，miRNA 表達(dá)的改變可作為RA 治療的潛在標(biāo)志物。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，RASFs 中miR-335-5p 相對(duì)表達(dá)量降低，提示miR-335-5p 可能與RA 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

通常miRNAs 通過(guò)作用不同的靶點(diǎn)介導(dǎo)多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，調(diào)控其下游mRNA 靶基因的表達(dá)[22-23]。多項(xiàng)研究表明，miR-335-5p 可靶向多種mRNA，如miR-335-5p 通過(guò)靶向ICAM-1 抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[24]；miR-335-5p 通過(guò)靶向BCL2L2 提高順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的敏感性[25]；miR-335-5p 通過(guò)下調(diào)LDHB 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[26]；miR-335-5p 通過(guò)靶向c-jun-N末端激酶3 抑制β-淀粉樣蛋白積累，減輕認(rèn)知障礙[27]；膿毒癥小鼠模型中，miR-335-5p 通過(guò)靶向和抑制FASN 并激活A(yù)MPK/ULK1 信號(hào)通路從而減輕炎癥反應(yīng)[28]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，DKK1 3′UTR 包含了一個(gè)miR-335-5p 靶序列。在RASFs 中，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)DKK1 是miR-335-5p的直接靶點(diǎn)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-335-5p 模擬物的RASFs 中DKK1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低。過(guò)表達(dá)miR-335-5p 可以顯著抑制RASFs 的增殖和侵襲，并促進(jìn)RASFs 的凋亡。此外，過(guò)表達(dá)DKK1 顯著逆轉(zhuǎn)了miR-335-5p 對(duì)RASFs 的作用?？梢?jiàn)，miR-335-5p 通過(guò)促進(jìn)RASFs 凋亡，在RA 中發(fā)揮保護(hù)作用，延緩疾病進(jìn)展。

綜上所述，本研究探討miR-335-5p 及其靶基因DKK1對(duì)RASFs 的影響，并闡明了RA 可能的病理機(jī)制。雖然miR-335-5p 和DKK1 有望成為RA 的有效治療靶點(diǎn)，但是其完整的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。