清熱化痰合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

亓淑芬，張樂青*，丁 健，葛朝暉

（1.陽谷縣人民醫(yī)院，山東 陽谷 252300；2.陽谷縣市場監(jiān)管稽查大隊(duì)，山東 陽谷 252300；3.臨沂大學(xué)，山東臨沂 252000）

清熱化痰合劑由麻黃、杏仁、浙貝母、金銀花、生甘草等11味中藥組成，是我院傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方劑，是經(jīng)過長期臨床實(shí)踐，逐步整理完善而形成的有效方劑，用于治療流行性感冒及一般性感冒，癥見發(fā)熱、咳嗽、流涕、咽喉腫痛。此方以清熱解毒、化痰止咳為治則，其中金銀花、浙貝母和麻黃為君藥。麻黃堿作為麻黃的主要有效成分，有鎮(zhèn)咳平喘、解熱發(fā)汗、抗病原微生物等作用[1]；浙貝母具有散結(jié)消痛、清熱化痰等效用[2]；金銀花具有清熱解毒等功效，適用于治療熱毒痛癢、溫病發(fā)熱、脹滿下疾等疾病[3]。為了控制本醫(yī)院制劑的質(zhì)量，參照相關(guān)文獻(xiàn)，本文采用薄層色譜法（TLC）對方中的麻黃和浙貝母進(jìn)行定性鑒別，以高效液相色譜法（HPLC）對金銀花中的綠原酸進(jìn)行含量測定，并且經(jīng)驗(yàn)證，制定的方法準(zhǔn)確可靠，能有效控制清熱化痰合劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；FA1204型天平（上海菁海儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥

麻黃堿對照品（批號(hào)：171241-201007），貝母素甲對照品（批號(hào)：110750-200609），綠原酸對照品（批號(hào)：110753-201716），甘草對照藥材（批號(hào)：120904-201318），均由中國食品藥品檢定研究院提供。清熱化痰合劑（批號(hào)分別為20190516，20190518，20190520，陽谷縣人民醫(yī)院自制）。乙腈，甲醇，醋酸均為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室二次蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 麻黃鑒別 取本品30 ml，加濃氨1 ml，用乙醚萃取兩次，每次30 ml，合并兩次乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤攵燃淄? ml使其溶解，作為供試品溶液。按清熱化痰合劑處方比例及制劑工藝，制備缺少麻黃的陰性樣品溶液，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。另取麻黃堿對照品適量，加入二氯甲烷，制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷:甲醇:濃氨（4:1:0.1）為展開劑，展開，取出，晾干。噴茚三酮試液后，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 麻黃TLC鑒別

2.1.2 浙貝母鑒別 取本品30 ml，加濃氨1 ml，用二氯甲烷萃取兩次，每次30 ml，合并兩次二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)佣燃淄? ml使溶解，作為供試品溶液。按清熱化痰合劑處方比例及制劑工藝，制備缺少浙貝母的陰性樣品溶液，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。另取貝母素甲對照品適量，加二氯甲烷制成每1 ml含1 mg貝母素甲的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液各3 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨（17:2:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀溶液至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品溶液相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 浙貝母TLC鑒別

2.2 綠原酸含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h的綠原酸對照品25 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋置刻度，搖勻，作為對照品貯備液。再精密量取對照品貯備液1 ml至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為100 μg/ml對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取清熱化痰合劑2 ml，置入200 ml量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按清熱化痰合劑處方比例及制劑工藝，制備缺少金銀花的陰性樣品溶液，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱：Unitary C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1 %醋酸溶液-乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃；檢測波長為327 nm。

表1 梯度洗脫時(shí)間表

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取對照品溶液，供試品溶液及陰性樣品溶液，按2.2.4項(xiàng)色譜條件測定。結(jié)果表明，供試品溶液的色譜圖中，在與對照品溶液的色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且分離度好，而陰性樣品溶液在此保留時(shí)間處無干擾，即本方法的專屬性好。詳見圖3～5。

圖3 陰性樣品溶液HPLC圖譜

圖4 綠原酸對照品溶液HPLC圖譜

圖5 供試品溶液HPLC圖譜

2.2.6 線性關(guān)系考察 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度分別為20，40，60，80，100 g/ml的對照品溶液，按2.2.4項(xiàng)色譜條件測定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=28.106x-93.03（r=0.9980，n=5）。結(jié)果表明綠原酸在20～100 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 儀器精密度試驗(yàn) 取綠原酸對照品溶液（濃度為100 μg/ml），連續(xù)進(jìn)樣6次，每次精密吸取10 μl進(jìn)樣，測得綠原酸峰面積的RSD為0.58 %。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液，分別于配制后在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)，按2.2.4項(xiàng)色譜條件測定，測得綠原酸峰面積的RSD為0.83 %。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同批號(hào)的清熱化痰合劑6份，每份各2 ml，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.4項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果綠原酸的平均含量為6.115 mg/ml，RSD為1.38 %，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 精密量取6份已知含量的樣品（綠原酸含量為6.115 mg/ml）溶液，每份1 ml，分別精密加入1 ml綠原酸對照品溶液（3.0061 mg/ml），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。綠原酸平均回收率為98.06 %，RSD為1.16 %。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 樣品的含量測定 分別取3批清熱化痰合劑（批號(hào)分別為20190516，20190518，20190520），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.4項(xiàng)下色譜條件測定，3批樣品中綠原酸的含量分別為6.1151，6.106，6.139 mg/ml。

3 討論

麻黃的TLC鑒別中，分別采用正丁醇:冰醋酸:水（8:2:1）[4]、環(huán)己烷:三氯甲烷:甲醇（1:3:1）[5]、三氯甲烷:甲醇:濃氨試液（4:1:0.1）[6]為展開劑。結(jié)果以二氯甲烷:甲醇:濃氨試液（4:1:0.1）為展開劑時(shí)主斑點(diǎn)顯色更加清晰，各斑點(diǎn)間的分離效果好。

在浙貝母的TLC鑒別中，分別選用乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17:2:1）[7]、乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17:2:0.5）[8]、乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液-水（25:1:1:0.1）[9]為展開劑。結(jié)果以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17:2:1）為展開劑時(shí)主斑點(diǎn)顯色清晰，在與對照品斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

甘草作為此方劑中的使藥，用量較少，曾對甘草進(jìn)行TLC鑒別。參考《中國藥典》（2015年版）甘草項(xiàng)下鑒別方法及有關(guān)文獻(xiàn)資料，制備供試品溶液、甘草對照藥材溶液、甘草陰性對照溶液，分別選用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）[10]、乙酸乙酯-甲酸-水（8:3:1）[11]為展開劑，甘草陰性對照溶液無明顯干擾，但供試品溶液斑點(diǎn)不清晰，試驗(yàn)結(jié)果不理想，重現(xiàn)性差。故未將此方法收入標(biāo)準(zhǔn)。

綠原酸含量測定中在進(jìn)行流動(dòng)相選擇時(shí)，分別考察了乙腈-水-冰醋酸（15:85:0.2），乙腈-0.4 %磷酸溶液（12:88）系統(tǒng)，分離效果均不佳，色譜峰不能完全分離。改用0.1 %醋酸溶液-乙腈為流動(dòng)相，并采用梯度洗脫，色譜峰峰形較好，出峰時(shí)間較快，分離度好于其他條件且陰性無干擾。