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    有氧運動對衰老大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞自發(fā)瞬時外向流的影響

    2015-08-03 03:46:30張寒夢劉雨佳石麗君北京體育大學(xué)北京100084
    中國老年學(xué)雜志 2015年6期
    關(guān)鍵詞:亞基腸系膜平滑肌

    張寒夢 劉雨佳 石麗君(北京體育大學(xué),北京 100084)

    大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)是血管平滑肌細胞上廣泛分布的一類K+通道,在血管張力的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的負反饋調(diào)控作用〔1,2〕。自發(fā)瞬時外向流(STOCs)反饋性抑制VGCC,降低〔Ca2+〕i,對抗平滑肌的收縮,促使平滑肌舒張〔3〕。衰老會導(dǎo)致血管中間層彈性物質(zhì)的丟失,可誘導(dǎo)機體動脈結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重構(gòu)〔4〕,其中血管離子通道的表達和功能亦發(fā)生改變〔5〕。衰老可引起某些血管床BKCa通道的表達和功能下調(diào)〔6〕,使動脈的舒張能力減弱,外周阻力增高,從而血壓升高。與衰老相反,有氧運動對血壓的穩(wěn)定及血管功能的改善是有益的〔7,8〕。在青年大鼠腸系膜動脈上,有氧運動可以通過上調(diào)BKCaβ1亞基的功能使通道活性增加,從而誘發(fā)血管舒張能力增強〔9〕。但是衰老腸系膜動脈上STOCs有何變化特征以及有氧運動對其有怎樣的調(diào)控作用,至今尚未見文獻報道。本研究探討有氧運動對衰老大鼠腸系膜阻力動脈平滑肌細胞STOCs的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與分組 2月齡健康雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)至19~21月齡(老年組),隨機分為安靜組(O-SED,n=6)和有氧運動組(O-EX,n=6)。另選取2月齡雄性Wistar大鼠作為青年對照組(n=6)。按照國家標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)大鼠,自由飲食,溫度維持在22℃~24℃,相對濕度40%~60%,晝夜節(jié)律人工控制光照(光照時間為6:00~18:00)。

    1.2 訓(xùn)練方案 O-EX組大鼠先進行1 w適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練,之后進行 12 w 跑臺運動,坡度 0°,15 m/min,60 min/d,5 d/w。OSED組與Young組不運動。三組均于13 w結(jié)束后的24~48 h內(nèi)取材。

    1.3 主要試劑及藥品 牛血清蛋白(BSA)、I型膠原酶(type IS collagenase)、木瓜蛋白酶(papain)、F型膠原酶(type F collagenase)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、Iberiotoxin(IbTX)、蘭諾定(Ryanodine)均購自美國Sigma公司,其余為國產(chǎn)分析純試劑。Anti-KCa1.1(BKCa)和Anti-sloβ1(KCNMB1)購自以色列alomone公司。

    1.4 大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞分離 具體方法參見文獻〔9〕。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg),麻醉后迅速取出腸系膜動脈置于4℃無鈣分離液(PSS)Ⅰ中,小心剝離干凈腸系膜動脈上周圍脂肪組織,并將其剪成0.5~1 mm的小段。將組織轉(zhuǎn)移入酶Ⅰ(mg/ml):0.3 papain、1 DTT 和 1 BSA,37℃溫育25 min;之后去除酶Ⅰ,加入酶Ⅱ:1.5F型膠原酶、1Ⅰ型腹原酶和1 BSA,消化10 min。消化完畢后,組織用PSSⅡ洗3~4遍,鈍頭吸管輕輕吹打,制備細胞懸液,4℃保存?zhèn)溆?。分離平滑肌細胞緩沖液 PSSⅠ(mmol/L):137 NaCl,5.6 KCl,1.0 MgCl2,10.0 G-Glucose,10.0 HEPES,0.03 硝普納(NaOH 調(diào)節(jié)pH 至 7.4)。PSSⅡ(mmol/L):137 NaCl,5.6 KCl,1 MgCl2,10 HEPES,10 Glucose,0.42 Na2HPO4,0.44 NaH2PO4(NaOH 調(diào)節(jié)pH 至 7.3~7.4)。

    1.5 電生理實驗 采用兩性霉素B穿孔全細胞膜片鉗技術(shù)記錄STOCs,終濃度為250 μg/ml。玻璃微管電極采用微管電極拉制儀(PC-10,Narishige,Japan)進行兩步拉制,毛細玻璃管購自美 國 Sutter instrument(BF150-86-10,I.D 1.5 mm,O.D 0.86 mm,fire polished),拉制后電極尖端直徑約為 1~2 μm,充灌電極液后電極阻抗為4~5 MΩ。電極內(nèi)液成分(mmol/L):110 冬氨酸鉀(K-Asp),30 KCl,1 EGTA,3 Na2ATP,0.85 CaCl2,10 Glucose,10 HEPES(KOH調(diào)節(jié) pH 至 7.2);浴液成分(mmol/L):134 NaCl,10 HEPES,1 MgCl2,6 KCl,10 Glucose,1.8 CaCl2(NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4)。電流信號經(jīng)膜片鉗放大器(Axon 700B amplifier)放大,采樣頻率10 kHz,八極Bessel低通濾波頻率為2 kHz,在Clampex 10.0軟件控制下,進行A/D、D/A轉(zhuǎn)換。采用 Mini Analysis 6.0 program(Synaptosoft,Inc.,Decatur,GA,USA)對STOCs進行分析,STOCs閾值設(shè)為10 pA。所有實驗記錄都在室溫(22℃~25℃)下進行。

    1.6 蛋白免疫印跡分析各組腸系膜動脈BKCa通道α和β1亞基蛋白表達情況 稱取100 mg腸系膜動脈組織,迅速加入500 μlRIPA裂解液,用勻漿器在冰水浴中勻漿10次,每次4~5 s,間隔4~5 s。將勻漿液于4℃以13 000 r/min離心30 min,取上清液待測。按照常規(guī)操作進行蛋白濃度的測定、電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(上樣量每孔40 μg蛋白)、轉(zhuǎn)膜(BKCaα 亞基300 mA 恒流1.5 h;BKCaβ1 亞基250 mA恒流50 min)、5%BSA封閉2 h。加入用0.01 mol/L Tris鹽酸緩沖液(TBST)稀釋的一抗〔Anti-KCa1.1(BKCa),1∶300;Antisloβ1(KCNMB1),1∶200;β-actin(R-22):sc-130657,1∶300〕,室溫脫色搖床上搖動孵育1 h,4℃孵育過夜;0.01 mol/L TBST漂洗三次,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG〔1∶16 000(BKCaα 亞基);1∶2 000(BKCaβ1 亞基);1∶4 000(β-actin)〕孵育1 h。免疫蛋白活性由增強化學(xué)發(fā)光法檢測,并采用Quantity One軟件進行半定量分析。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

    2 結(jié)果

    2.1 STOCs的電壓依賴性及藥理學(xué)鑒定 鉗制電位(HP)為-50 mV,給予階躍電壓,即去極化步階10 mV,持續(xù)400 ms,遞增至80 mV,可記錄到全細胞的外向鉀電流??梢奡TOCs隨機性地疊加在全細胞電流上,隨著細胞膜去極化程度的增加,疊加在曲線上的STOCs幅度逐漸增加,但具有隨機性和不確定性。見圖1。如改變HP,分別鉗制在-40~0 mV,亦可記錄到STOCs(圖2A,2C,2D)。當(dāng) HP= -40 mV 時,STOCs出現(xiàn)的頻率和幅度均較低;當(dāng)HP增加到-30 mV以上時,即可觀察到明顯的STOCs。STOCs的幅值隨著細胞膜去極化程度的增加呈現(xiàn)出顯著增加,表現(xiàn)為明顯的電壓依賴性特征。對比-40 mV,STOCs頻率亦顯著增加,但 -30 mV、-20 mV、-10 mV、0 mV之間無顯著差異。選用蘭諾定受體阻斷劑(RYR,50 μmol/L)或BKCa通道的特異性阻斷劑(IbTX,100 nmol/L)分別孵育細胞2 min,可見STOCs活性顯著被抑制(圖2B),提示STOCs為蘭諾定受體和BKCa通道介導(dǎo)。

    圖1 穿孔膜片鉗記錄2月齡青年大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞的STOCs(階躍電壓模式)

    圖2 青年大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞STOCs電壓依賴性和藥理學(xué)鑒定

    2.2 有氧運動對衰老腸系膜動脈平滑肌細胞STOCs的影響 在相同HP下,STOCs的幅值和頻率均為Young組最大,其次為O-EX組,而O-SED組最低。如圖3所示,當(dāng)HP=-30 mV時,STOCs的幅值分別為(32.6±2.4)pA(Young)組、(11.4±0.7)pA(O-SED)組和(20.2±2.8)pA(O-EX)組;而頻率分別為(4.50±0.40)Hz(Young)組、(1.40±0.20)Hz(O-SED)組和(2.50±0.40)Hz(O-EX)組。與 Young組比較,老年組(OSED和O-EX)STOCs的幅值和頻率均顯著下降(P<0.01);而進行有氧運動訓(xùn)練的老年組(O-EX)又顯著高于安靜組(OSED,P<0.01),提示有氧運動顯著抑制了衰老誘發(fā)的STOCs活性減弱。

    圖3 有氧運動對衰老大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞STOCs的影響

    2.3 有氧運動對衰老腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa通道α和β1亞基表達的影響 分別采用BKCa通道α和β1亞基的特異性抗體〔Anti-KCa1.1(BKCa)和 Anti-sloβ1(KCNMB1)〕,可以檢測到125 kD(α亞基)和28 kD(β1亞基)的蛋白表達。與Young組相比,O-SED組和O-EX組α和β1亞基表達均顯著下降(P<0.01);然而O-EX組卻顯著高于 O-SED組(P<0.01)。α亞基蛋白表達:Young組(1.00±0.00)> O-EX組(0.72±0.17)>O-SED組(0.65±0.11)。β1亞基蛋白表達亦呈此變化趨勢,Young組(1.00±0.00)> O-EX 組(0.65±0.05)>O-SED 組(0.29±0.07)。見圖4。

    圖4 有氧運動對衰老大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa通道α亞基和β1亞基表達的影響

    3 討論

    有氧運動的降壓效應(yīng)已得到國內(nèi)外專家普遍的肯定〔10〕,運動控制血壓的機制很多,其中運動對動脈平滑肌鉀離子通道的調(diào)控作用日益受到關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn):(1)衰老使STOCs活性下降,表現(xiàn)為相同鉗制電位下STOCs的幅值和頻率均顯著降低;(2)蛋白免疫印跡分析顯示衰老細胞BKCa的α和β1亞基表達均下降;(3)有氧運動顯著抑制了上述衰老誘發(fā)的變化。此結(jié)果提示,衰老可以通過BKCa亞基分子表達下調(diào)的方式降低BKCa功能,并減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng) RyRs和 BKCa之間的功能耦聯(lián),使STOCs活性減弱,從而誘導(dǎo)膜去極化、血管外周阻力增加;而長期規(guī)律性有氧運動能顯著逆轉(zhuǎn)這些變化,這可能是運動改善衰老血管功能、緩解血管張力和降低血壓的重要機制之一。

    在BKCa通道的研究過程中,常規(guī)全細胞模式會導(dǎo)致細胞內(nèi)容物丟失、巨阻封接細胞脫落、細胞碎片堵住破口處造成記錄電流衰減假象等問題〔11〕。而且,由于細胞內(nèi)鈣緩沖能力的變化,此模式很難記錄到STOCs〔12〕。因此常規(guī)全細胞膜片鉗記錄法在某些特定研究中受到限制。本實驗采用的是穿孔膜片鉗法,利用兩性霉素B在磷脂雙分子層中形成孔道,小孔的大小只允許一價離子通過,其優(yōu)點主要有:(1)大分子和高價離子不通透,避免胞內(nèi)重要物質(zhì)滲析,因此對離子通道起調(diào)控作用的物質(zhì)濃度不受影響,電流衰減現(xiàn)象減慢;(2)高阻封接很穩(wěn)固,可長時間持續(xù)記錄;(3)電極串聯(lián)電阻并未升高且相當(dāng)穩(wěn)定,補償后準確性很好,減少了補償不準確帶來的誤差。本實驗選用穿孔膜片鉗模式,于急性分離的大鼠腸系膜平滑肌細胞上成功地記錄到了STOCs,記錄可持續(xù)1~2 h。

    本實驗中記錄到的STOCs具有隨機性,幅值隨著細胞膜的去極化程度而呈上升趨勢,表現(xiàn)為明顯的電壓依賴性。如上所述,STOCs使細胞膜首先復(fù)極化、超極化,隨后反饋性抑制VGCC,使其關(guān)閉,鈣內(nèi)流減少,從而使胞內(nèi)Ca2+濃度下降,血管舒張,完成對血管收縮的負反饋調(diào)節(jié)。因此,STOCs與RyRs以及BKCa的表達和功能有直接的關(guān)系。許多血管活性物質(zhì)都是通過對鈣火花幅值和頻率的調(diào)控以及對RyRs與BKCa通道的耦聯(lián)來實現(xiàn)對血管張力的調(diào)節(jié)的〔13〕。Ryanodine是RyRs的特異性阻斷劑,它能夠以極高的親和力與RyRs迅速結(jié)合,完全阻斷RyRs的活動。而IbTX作為BKCa通道的特異性阻斷劑,可用于鑒別BKCa電流。本實驗結(jié)果說明STOCs確為RyRs和BKCa所介導(dǎo)。

    本實驗還發(fā)現(xiàn),有氧運動顯著逆轉(zhuǎn)了衰老誘發(fā)的STOCs活性減弱。由于STOCs是鈣火花誘發(fā)的臨近細胞膜上BKCa通道的開放,因此該通道在細胞膜上的表達密度將顯著影響STOCs的幅值?,F(xiàn)已明確,血管平滑肌細胞BKCa由α和β1亞基組成,自發(fā)性高血壓大鼠的BKCa通道活性增強并伴有α亞基的表達增加〔13〕。另有研究證實β1亞基的下調(diào)或減少均可使BKCa通道功能下降〔14〕。Nishimaru等〔15〕檢測了幼齡和老齡 F344大鼠冠狀動脈的BKCa的亞基組成,發(fā)現(xiàn)增齡可導(dǎo)致α亞基和β1亞基蛋白表達和功能下降;但Nishimaru等〔16〕研究表明在衰老大鼠腦動脈BKCa表達并未發(fā)生變化,提示增齡所致的BKCa通道結(jié)構(gòu)和功能變化有組織特異性。本研究結(jié)果提示,規(guī)律性有氧運動訓(xùn)練可以顯著抑制BKCa通道組成亞基的蛋白表達下降,這可能是各組STOCs差異的重要原因。

    綜上所述,衰老可誘發(fā)大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa的α和β1亞基下調(diào),從而使STOCs減弱、膜去極化和外周阻力增加;而規(guī)律性有氧運動可顯著抑制此變化,這可能是運動誘導(dǎo)衰老血管逆重構(gòu)、緩解血管張力增高的重要機制。

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