貴州地區(qū)漢族人群BChE基因單核苷酸多態(tài)性與膽囊結(jié)石發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性分析

詹磊，孫誠誼

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550000）

膽囊結(jié)石疾病作為極為常見的消化系統(tǒng)疾病，在西方人群發(fā)病率為10%～20%[1]，我國目前已經(jīng)接近發(fā)達(dá)國家水平，達(dá)到8%～10%，該病是由于膽固醇代謝的平衡紊亂所引起[2]。目前對于該疾病的醫(yī)療花費(fèi)已經(jīng)呈現(xiàn)逐年增長的趨勢[3]。盡管已有大量研究[4-6]從基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)的角度探索膽囊結(jié)石的成因，但目前對膽囊結(jié)石形成的分子機(jī)制仍不十分明確。結(jié)石形成的相關(guān)危險因素包括，肥胖、2型糖尿病及胰島素分泌紊亂等。因此，越來越多研究者[7-9]支持膽囊結(jié)石作為一個代謝綜合征性質(zhì)的疾病影響患者健康及生活質(zhì)量。越來越多的研究[10-11]開始關(guān)注在表觀遺傳領(lǐng)域，即環(huán)境因素的改變影響基因組的表達(dá)與功能從而最終影響膽囊結(jié)石的生成。

?；憠A水解酶（cholinesterase，ChE）是一類在體內(nèi)催化酰基膽堿水解的酶類。ChE以兩種形式存在于體內(nèi)：其一為乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE），主要分布在神經(jīng)組織中；其二為丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BChE），作為已被公認(rèn)的重要脂肪代謝調(diào)控參與者，其主要分布在腸黏膜、肝臟、胰腺和血漿中，大量研究已確立了BChE與異常的脂肪代謝具有重要關(guān)聯(lián)。這種聯(lián)系在糖尿病患者、脂肪肝患者和超重患者中尤為明顯，表現(xiàn)為血清總膽堿酯酶均升高[12-13]。作為肥胖相關(guān)基因，BChE的表達(dá)異常與脂質(zhì)代謝失常有明顯的關(guān)系，而膽囊結(jié)石疾病作為代謝異常綜合征已被證明與肥胖密切相關(guān)[14-15]。目前尚未有發(fā)表任何關(guān)于肥胖相關(guān)基因BChE rs1126680以及rs1803274單核苷酸多態(tài)性（SNP）突變與膽囊結(jié)石發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的研究。在貴州地區(qū)漢族人群中這些SNP與膽囊結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性就更不明確。本研究在受試人群中篩選BChE rs1126680以及rs1803274兩個突變位點(diǎn)與人群中的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）狀態(tài)進(jìn)行相關(guān)性分析。最后通過TaqMan?SNP基因分型工具對收集的樣本進(jìn)行分型檢測，以期探討這兩個位點(diǎn)SNP在受試人群中對膽囊結(jié)石發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

所有的膽囊結(jié)石疾病病例和健康對照樣本分別來源于2013—2016年貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科因膽囊結(jié)石疾病進(jìn)行住院治療的患者，以及于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的健康人群。研究協(xié)議及試驗(yàn)流程經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并進(jìn)行全程監(jiān)督（倫理批準(zhǔn)號：GYGDWK-01），整項(xiàng)研究獲得所有受檢測參與者的書面知情同意。從296例受試者中獲得其合格的全血樣品，其中包括膽囊結(jié)石疾病患者171例，健康對照組人群125例。合并有肝、腎及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的膽囊結(jié)石患者不被納入該項(xiàng)研究。患者及健康體檢者入組后，均簽署知情同意書，采全血樣本10 mL，提取DNA。

1.2 研究方法

1.2.1 人基因組DNA 的提取及純化利用MagCore Compact 核酸抽提儀（芮寶生醫(yī)股份公司，臺灣），以MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit（Cat.No.MGB400-04）試劑盒提取全血基因組DNA，取DNA 樣本2 μL 用NanoDrop 測定DNA純度和濃度，確保OD260/OD280＞1.8 至2.0 之間。

1.2.2 TaqMan? 熒光探針檢測及SNP 基因分型3 個SNP 基因型的探針序列及基因信息見表1。反應(yīng)體系是由20×，40×，80×TaqMan?Genotyping Assay以及TaqMan?Genotyping Master Mix，nuclease-free 水所組成。標(biāo)準(zhǔn)的PCR 反應(yīng)體系的建立應(yīng)當(dāng)為5 μL 體系/孔（384 孔PCR 反應(yīng)板）；10 μL 體系/孔（96 孔PCR 反應(yīng)板），按照標(biāo)準(zhǔn)建立反應(yīng)體系。采用安捷倫mx3000p?序列檢測系統(tǒng)（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）利用VIC?和FAM?兩個熒光檢測通道進(jìn)行基因變異檢測。繪制位基因分型/SNP 實(shí)時熒光定量散點(diǎn)分布圖，并進(jìn)行等位基因分型/SNP 實(shí)時熒光定量最終結(jié)果判定[16-18]。

表1 探針序列及基因信息Table 1 Probe sequence and gene information

1.2.3 BChE 基因2 個多態(tài)位點(diǎn)與膽囊結(jié)石發(fā)病風(fēng)險分析為了分析BChE rs1126680 以及rs1803274 等位基因基因型與膽囊結(jié)石疾病的臨床特征相關(guān)性，采用二元Logistic 回歸分析的方法進(jìn)行相關(guān)評估。關(guān)于crude odds ratio 的計算，以是否發(fā)生膽囊結(jié)石疾病作為因變量，而rs1126680以及rs1803274 的基因分型則作為獨(dú)立變量。通過Logistic 回歸分析將等位基因的分型數(shù)據(jù)與膽囊結(jié)石疾病的發(fā)生作為獨(dú)立危險因素進(jìn)行建模判斷，更進(jìn)一步的將膽囊結(jié)石的發(fā)生通過危險分層的方法與年齡，性別，BMI 進(jìn)行確定與調(diào)整。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有的生化指標(biāo)以及基因表達(dá)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。對計量資料的組間比較使用t檢驗(yàn)。等位基因頻率計算采用的是直接計數(shù)方法，采用Pearson χ2檢驗(yàn)或者Fisher's確切分析。使用Hardy-Weinberg平衡以及各等位基因型樣本大小的差異。采用二元Logistic回歸分析的方法進(jìn)疾病危險因素評估。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 資料分析

膽囊結(jié)石疾病組與健康人群除在血液中，低密度脂蛋白（LDLC）與高密度脂蛋白（HDLC）存在明顯差異（P=0.028、P=0.015），其余臨床指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。膽囊結(jié)石患者組平均年齡為（46.1±9.2）歲，健康對照組平均年齡為（53.2±5.6）歲，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.267）。其中膽囊結(jié)石患者組（男72例，女99例）和健康對照組（男51例，女74例）性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.905），組間具有可比性（表2）。等位基因位點(diǎn)基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.641，P＞0.05），選擇的樣本具有群體代表性。

表2 受試者臨床特征分析Table 2 The clinical features of the studied subjects

2.2 ABCG8 rs11887534，BChE rs1803274 以及rs1126680 的等位基因頻率分布

TaqMan?探針基因分型結(jié)果顯示，3個標(biāo)簽SNP成功分型，并且每個標(biāo)簽SNP的分型成功率99.3%（圖1）。ABCG8基因（D19H）rs11887534作為陽性對照與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[46]。BChE rs1803274（P=1.312×10-15）多態(tài)性與膽囊結(jié)石疾病的發(fā)生存在相關(guān)性。與對照組相比隨著rs1803274雜合子等位基因的增加，人群患膽囊結(jié)石疾病的風(fēng)險將會增加。然而肥胖相關(guān)基因BChE rs1126680（P=0.616）與膽囊結(jié)石疾病無關(guān)（表3-4）。

2.3 BChE rs1803274 與膽囊結(jié)石臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析

對膽囊結(jié)石受試組各等位基因的基因表型，也就是攜帶純合子CC，雜合子CT和純合子TT基因型的BChE rs1803274的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過Logistic回歸分析將等位基因的分型數(shù)據(jù)與膽囊結(jié)石疾病的發(fā)生作為獨(dú)立危險因素進(jìn)行建模判斷，更進(jìn)一步的將膽囊結(jié)石的發(fā)生通過危險分層的方法與年齡，性別和BMI進(jìn)行確定與調(diào)整。BChE rs1803274雜合子CT突變可以作為膽囊結(jié)石疾病發(fā)病的獨(dú)立遺傳風(fēng)險因素。Logistic回歸分析的建模與結(jié)果表明，在女性人群中BChE rs1803274雜合子CT基因型將比純合子CC及純合子TT存在更高的膽囊結(jié)石疾病的發(fā)病風(fēng)險（95% CI=0.237～0.772，P=0.009）。

圖1 基因分型散點(diǎn)圖 A：rs11887534 分型；B：rs1803274 分型；C：rs1126680 分型Figure 1 Scatter plots of genotyping A:The rs11887534;B:The rs1803274;C:The rs1126680

表3 目標(biāo)等位基因SNP 信息Table 3 Information of the target alleles

表4 膽囊結(jié)石患者目標(biāo)基因SNP 突變頻率[n（%）]Table 4 Frequency of mutation of the SNPs of the target genes in patients with gallstones[n (%)]

3 討論

膽囊結(jié)石疾病在歐美發(fā)達(dá)地區(qū)是非常普遍的一種消化系統(tǒng)疾病，和亞洲及非洲人群相比，其發(fā)病率更高[1]。這種差異被認(rèn)為可能與飲食習(xí)慣和遺傳因素有關(guān)[19-22]。在296例受試者中，包括171例膽結(jié)石受試者以及125例健康對照樣本中，隨著BChE基因rs1803274突變，膽囊結(jié)石疾病的發(fā)病風(fēng)險明顯增加。rs1803274雜合子CT在貴州省漢族受試人群中與膽囊結(jié)石發(fā)病相關(guān)。作為陽性對照，所有ABCG8 D19H的突變與臨床情況類似于以前的相關(guān)報道[23]，這也同時證明了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。本研究還比較了膽囊結(jié)石患者與健康對照組的相關(guān)臨床特征，膽囊結(jié)石患者組的LDLC均明顯高于對照組，然而膽囊結(jié)石患者組的HDLC則明顯低于健康組。

膽囊結(jié)石的形成是受多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，該疾病受到遺傳和環(huán)境的雙重影響，是一種代謝紊亂綜合征。膽結(jié)石形成的遺傳易感、危險因素主要包括年齡，性別，肥胖，以及特定藥物的使用[24]。大量研究已確立了BChE與異常的脂肪代謝具有重要關(guān)聯(lián)。這種聯(lián)系在糖尿病患者、脂肪肝患者和超重患者中尤為明顯，表現(xiàn)為血清總膽堿酯酶均升高。Cucuianu等[12]報道2型糖尿病體質(zhì)量超重的患者，其血清BChE顯著升高，并且提出BChE對血清胰島素、游離脂肪酸和C肽的表達(dá)具有明顯的調(diào)控作用。該研究還指出糖尿病疾病模型犬血清BChE水平顯著升高，合并肥胖的犬血清BChE含量進(jìn)一步增加。糖尿病模型家兔BChE高于對照組，給予抗膽堿酯酶藥溴化斯的明治療后，空腹血糖含量明顯下降[25]。研究[26]提出血清BChE升高是脂肪肝的突出生化指標(biāo)的觀點(diǎn)，血清中BChE指標(biāo)更加能夠反映肝臟對脂肪代謝能力。隨著我國經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，中國人群飲食總體熱量逐年增高[27]。人群的運(yùn)動量開始減少，脂肪消耗也減少，從而極易造成脂肪堆積，引發(fā)高脂血癥和肥胖癥[28]。值得注意的是，在糖尿病合并高脂血癥的患者中，體內(nèi)脂肪酸合成和轉(zhuǎn)化增加，肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪增多，脂肪變性的肝細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致肝中?；o酶A大量累積，其進(jìn)一步代謝產(chǎn)物可產(chǎn)生大量酰基膽堿，而正是?；憠A成為血清ChE的主要底物。所以血清中BChE含量升高可能是由于大量底物誘導(dǎo)肝合成酶增加而形成[29]。BChE作為肥胖相關(guān)基因，其表達(dá)出現(xiàn)異常提示著紊亂的脂質(zhì)代謝過程，這與膽囊結(jié)石疾病的發(fā)生有著極強(qiáng)的聯(lián)系[30]。

BChE基因在脂質(zhì)代謝及代謝紊亂綜合征的發(fā)生發(fā)展過程中扮演極為重要的角色，但是，BChE基因與膽囊結(jié)石疾病的聯(lián)系及該基因SNP突變對膽囊結(jié)石產(chǎn)生的相關(guān)研究卻仍屬空白。本研究通過病例對照研究探討貴州地區(qū)漢族人群肥胖基因BChE基因SNP位點(diǎn)與膽囊結(jié)石疾病發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。選取171例貴州省漢族膽囊結(jié)石患者和125例健康對照者入組。采用TaqMan?探針技術(shù)，對肥胖相關(guān)基因BChE rs1126680、rs1803274進(jìn)行基因分型。發(fā)現(xiàn)隨著BChE rs1803274 SNP突變，人群患膽囊結(jié)石疾病的風(fēng)險將會升高，更加增加了女性罹患膽囊結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險。然而肥胖相關(guān)基因BChE rs1126680為與膽囊結(jié)石疾病發(fā)病風(fēng)險無意義的突變位點(diǎn)。本研究為膽囊結(jié)石的成因研究及膽囊結(jié)石遺傳易感性檢測相關(guān)研究提供了最新的工作基礎(chǔ)。