不同種植體上部結(jié)構(gòu)對(duì)犬牙齦組織的影響

周美玲,于晉,屈直,王稚英

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,遼寧 錦州 121000)

烤瓷熔附金屬(porcelain fused to metals，PFM)全冠能完整恢復(fù)牙體的形態(tài)及功能，抗折力強(qiáng)，且顏色、外觀逼真，色澤穩(wěn)定，表面光滑，耐磨性和抗沖擊性強(qiáng)，是目前臨床上較為常用的固定修復(fù)方法。但牙科合金的金屬元素釋放是一個(gè)潛在影響牙科病人的健康問(wèn)題[1]。眾所周知，金屬能引起皮膚的過(guò)敏或誘導(dǎo)炎癥發(fā)生反應(yīng)，而這些都是金屬元素被釋放的結(jié)果，其會(huì)造成相鄰組織的細(xì)胞生物毒性[2-3]。鑄造修復(fù)體被放置在與口腔組織密切接觸的各個(gè)不同部位可能會(huì)引起接觸部位或相鄰組織不良反應(yīng)如牙齦炎和牙周炎。鎳離子可以在人類(lèi)口腔黏膜細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞聚集，激活單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞抑制或促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子1表達(dá)[4-5]。此外，鎳能夠誘導(dǎo)表面抗原的表達(dá)調(diào)控，而高濃度的LPS影響刺激巨噬細(xì)胞的基本功能[6-7]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)已被報(bào)道與許多骨吸收和炎癥相關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移，細(xì)胞凋亡和壞死。本研究主要研究?jī)煞N金屬全冠修復(fù)體對(duì)于犬牙齦組織中TNF-α和NF-κB的表達(dá)量，用于對(duì)臨床種植體上的金屬全冠的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

金剛砂車(chē)針(日本MANI)、硅橡膠印模材(瑞士康特coltene RAPID LINER)、美佳境A+種植體(臺(tái)灣美佳境)、3M ESPE水門(mén)汀粘結(jié)劑、環(huán)氧樹(shù)脂(美國(guó)3M ESPE公司)；鎳鉻合金(北京樂(lè)樂(lè)嘉齒科有限公司)；鈷鉻合金(鈷不少于25%，鉬不少于4%，鈷、鎳、鉻3種加起來(lái)不少于85%，北京樂(lè)樂(lè)嘉齒科有限公司)；LEICA EM UC6超薄切片機(jī)(德國(guó) LEICA公司)；JEM-1200EX 型透射電子顯微鏡(日本電子公司)；ZEISS A1光學(xué)顯微鏡(ZEISS 公司)；CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析儀(北京大恒圖像視覺(jué)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇及分組

選擇清潔級(jí)、健康成年雄性雜種犬12只，年齡2歲，質(zhì)量15～18 kg。前期試驗(yàn)中每只犬每側(cè)下頜均有2顆種植體；右側(cè)制作鎳鉻合金PFM冠，左側(cè)制作鈷鉻合金PFM冠，上頜同名牙位為正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)于2017年9月至2018年2月在錦州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院口腔科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物犬生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0002。

1.3 標(biāo)本獲取與處理

1.4 牙齦組織病理變化

切取每顆修復(fù)體對(duì)應(yīng)的犬牙齦及其上頜同名牙位健康犬牙齦一小塊，放入質(zhì)量濃度為4%多聚甲醛固定液中固定24 h。常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，制成5 μm厚切片，行HE染色。光鏡下牙齦組織病理變化。

1.5 Western Blot檢測(cè)NF-κB、TNF-α的表達(dá)

組織蛋白提取，配制SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜浸泡于含5%的脫脂乳的PBS中，4 ℃封閉過(guò)夜。次日，棄掉封閉液，立即加入一抗(稀釋，稀釋液為5%的脫脂乳)與PVDF膜一同在37 ℃水平搖床中孵育1 h。棄掉稀釋的一抗溶液，PBST漂洗3次，每次5 min，以二抗(稀釋，稀釋液為5%的脫脂乳)孵育，室溫水平搖床中孵育1 h。棄掉二抗，PBST漂洗3次，每次5 min。孵育底物1 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，比較正常對(duì)照組與各處理組之間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

術(shù)后各組犬均成活，精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)正常，全冠無(wú)脫落進(jìn)入結(jié)果分析。

2.1 術(shù)后牙齦組織形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后第3個(gè)月：光鏡下觀察到鎳鉻實(shí)驗(yàn)組，鈷鉻實(shí)驗(yàn)組牙齦組織形態(tài)均有充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞空泡，而正常對(duì)照組血管充血較輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，見(jiàn)圖1A、圖1B、圖1C。

術(shù)后第6個(gè)月：鎳鉻實(shí)驗(yàn)組牙齦有充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，空泡面積比鈷鉻合金組要多，并且棘層增生明顯，而正常對(duì)照組炎細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，見(jiàn)圖2A、圖2B、圖2C。

術(shù)后第12個(gè)月：鎳鉻合金牙齦組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，棘層變化明顯，重度異常增生，并突破基底膜向結(jié)締組織侵潤(rùn)生長(zhǎng)，鈷鉻合金組牙齦組織無(wú)炎癥，無(wú)血管充血，正常對(duì)照組炎細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，見(jiàn)圖3A、圖3B、圖3C。

2.2 Western blot檢測(cè)

2.2.1 NF-kB的表達(dá)情況

鎳鉻合金組在術(shù)后3個(gè)月有少量表達(dá)，與鈷鉻合金組相有明顯差異(P<0.05)，術(shù)后6個(gè)月、12個(gè)月與鈷鉻合金組相比顯著表達(dá)(P<0.01)，在12個(gè)月表達(dá)量最多，見(jiàn)表1、圖4。

A：正常對(duì)照組；B：鎳鉻合金修復(fù)體;C：鈷鉻合金修復(fù)體

A：正常對(duì)照組；B：鎳鉻合金修復(fù)體;C：鈷鉻合金修復(fù)體

A：正常對(duì)照組；B：鎳鉻合金修復(fù)體;C：鈷鉻合金修復(fù)體

表1 NF-kB在不同時(shí)期的表達(dá)量的灰度值比較

2.2.2 TNF-α的表達(dá)情況

鎳鉻合金組在術(shù)后3個(gè)月有少量表達(dá)，與鈷鉻合金組相有明顯差異(P<0.05)，術(shù)后6個(gè)月12個(gè)月與鈷鉻合金組相比顯著表達(dá)(P<0.01)，在12個(gè)月表達(dá)量最多，見(jiàn)表2、圖4。

表2 TNF-α在不同時(shí)期的表達(dá)量的灰度值比較

圖4 Western blot結(jié)果

3 討 論

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，口腔中的金屬材料在戴用一段時(shí)間后，在合金周?chē)墓纹把例l中均可發(fā)現(xiàn)析出的金屬離子，唾液中的離子濃度也會(huì)升高，產(chǎn)生不利的生物學(xué)效應(yīng)[8-10]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HE染色中，鎳鉻合金會(huì)造成牙齦組織形態(tài)學(xué)的改變，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈加重趨勢(shì)，說(shuō)明這些釋放的金屬元素和其他的蛋白結(jié)合形成有害于局部或者全身的化合物，造成機(jī)體損害。有研究顯示長(zhǎng)期接觸低濃度的Ni和Cr離子元素，可能導(dǎo)致在腎臟的積累[11]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金組會(huì)導(dǎo)致有牙齦炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生的主要因素常常是炎癥前遞質(zhì)的功能紊亂，因此評(píng)估合金的生物相容性可以考察其對(duì)炎癥前遞質(zhì)分泌和表達(dá)的影響，其中TNF-α無(wú)論對(duì)于一般的組織還是牙周組織都是重要的炎性遞質(zhì)。何慧明等[12]研究表明，用LPS刺激不同牙科金屬材料，TNF-α、白細(xì)胞介素1α等細(xì)胞因子會(huì)被單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌。Horowitz等[13]人發(fā)現(xiàn)，把鈷鉻合金和巨噬細(xì)胞放到一起培養(yǎng)，可以導(dǎo)致TNF-α的產(chǎn)生，但不會(huì)造成明顯的TNF-α、IL-6的產(chǎn)生。

口腔上皮組織在炎癥和腫瘤的入侵和改造的情況下，病變的炎癥或腫瘤組織組織會(huì)造成TNF-α激活NF-κB，造成基質(zhì)TNF-α和NF-κB的過(guò)度表達(dá)，炎癥和腫瘤組織是它們之間鏈接的通道[14]。NF-κB促進(jìn)白細(xì)胞介素2的轉(zhuǎn)錄和介入T細(xì)胞的活化及促炎性細(xì)胞因子的反應(yīng)，許多類(lèi)型的細(xì)胞，如TNF、IL-1和細(xì)菌脂蛋白[15]。據(jù)Alifui-Segbaya等[16]的研究，在炎癥過(guò)程中激活NF-κB誘發(fā)病變的惡變，這種細(xì)胞因子參與T細(xì)胞的活化從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的IL-2和促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子的反應(yīng)；在炎性浸潤(rùn)的條件下， NF-κB和TNF-α的過(guò)度表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了這一點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)Western blot檢測(cè)表明鎳鉻合金引起NF-κB和TNF-α分泌的增加在第3個(gè)月和第6個(gè)月第12個(gè)月均有，鈷鉻合金在第3個(gè)月和第6個(gè)月均引起NF-κB和TNF-α的增加，但第12個(gè)月NF-κB和TNF-α減少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各種金屬材料間的刺激性有差異，不同材料對(duì)于細(xì)胞因子的分泌影響是不同的，并且在相同條件下，NF-κB和TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)采用Western blot對(duì)鎳鉻合金和鈷鉻合金修復(fù)后局部牙齦組織的NF-κB及TNF-α的分析結(jié)果表明：種植戴用兩種修復(fù)體3個(gè)月后，局部牙齦組織中的NF-κB及TNF-α含量升高，說(shuō)明戴用兩種修復(fù)體后，基底合金金屬離子會(huì)滲透到牙齦組織中，并且HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核固縮，空泡性變，表明局部有炎癥的產(chǎn)生，并且黑白灰度值檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)鈷鉻合金和鎳鉻合金兩者之間有差異，說(shuō)明兩種金屬間刺激性不同；戴用6個(gè)月后，鎳鉻合金周?chē)例l組織中的NF-κB及TNF-α表達(dá)含量持續(xù)增高，鈷鉻合金修復(fù)體周?chē)腘F-κB及TNF-α表達(dá)含量有所減少，灰度值的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鈷鉻合金和鎳鉻合金有明顯差異，HE染色圖片發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金中的上皮棘層組織增生要比鈷鉻合金明顯，說(shuō)明鈷鉻合金的炎癥逐漸減輕，鎳鉻合金隨著時(shí)間的增加有加重趨勢(shì)；戴用兩種修復(fù)體12個(gè)月后，鎳鉻合金的NF-κB及TNF-α表達(dá)含量持續(xù)增多，鈷鉻合金的NF-κB及TNF-α表達(dá)含量持續(xù)降低，兩者之間的黑白灰度值檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鈷鉻合金與鎳鉻合金相對(duì)比有顯著差異，HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈷鉻合金組上皮組織恢復(fù)明顯，而鎳鉻合金組上皮重度異常增生，并突破基底膜向結(jié)締組織侵潤(rùn)生長(zhǎng)，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，鎳鉻合金組的刺激明顯，炎癥因子的表達(dá)明顯，鈷鉻合金組隨著時(shí)間改變，癥狀逐漸減輕，表明兩者雖然刺激性不同，但是鈷鉻合金明顯優(yōu)于鎳鉻合金，鈷鉻合金組的NF-κB及TNF-α表達(dá)含量的減少的原因需要今后實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步的研究。