丹參葉柄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及EDT1基因的導(dǎo)入

張換樣，李靜，朱永紅，秦麗霞，竹夢婕，吳慎杰，焦改麗

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000)

丹參是著名的傳統(tǒng)中草藥之一，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療高血脂，心腦血管，和急性缺血性中風(fēng)等疾病.以丹參為主的多種復(fù)方制劑如復(fù)方丹參注射液、復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參膠囊和復(fù)方丹參滴丸等被廣泛用于臨床治療心血管疾病、腎病、肝病及抗感染等[1].

我國大部分丹參種植區(qū)位于黃土高原干旱半干旱生態(tài)區(qū)，常年降雨量較少，丹參生長期內(nèi)常受到干旱脅迫，干旱脅迫引起丹參根部生長不良，對丹參的生長發(fā)育和藥用成分造成很大影響,因此增強(qiáng)丹參抗旱能力有非常重要的意義[2-3].高效的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系，對于創(chuàng)制優(yōu)良丹參種質(zhì)資源、研究丹參代謝調(diào)控機(jī)理具有重要意義[4-6].目前不少研究單位已經(jīng)初步建立了丹參的遺傳轉(zhuǎn)化體系.但常用的以丹參葉片和莖段為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，存在不易操作，分化率低等很多問題.本研究以葉柄為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化可以有效解決這些問題.從擬南芥耐旱突變體edt1中分離克隆出的EDT1基因,在干旱脅迫下調(diào)控一系列耐旱基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo),在野生型擬南芥和煙草中過表達(dá)EDT1,不但顯著增強(qiáng)抗旱性與改良根系構(gòu)型,提高光合效率和水分利用率.本研究以葉柄為外植體擬建立一套高效的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系，并將EDT1基因轉(zhuǎn)入常規(guī)的丹參栽培品種中，以期獲得抗旱性增強(qiáng)的優(yōu)良丹參種質(zhì)材料[7].

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 受體材料 本研究選用HLM(成都電子科技大學(xué)提供)為受體丹參品種.

1.1.2 外源植物表達(dá)載體 外源植物表達(dá)載體為pCB3000-EDT1為人工合成載體，pCB系列的植物表達(dá)載體及相關(guān)元件已在植物基因操作中廣泛應(yīng)用[7]，所用啟動子為35S啟動子，控制基因在轉(zhuǎn)基因植物不同的組織和器官內(nèi)都有表達(dá)，長835 bp，來自花椰菜花葉病毒.終止子為Nos，來源為農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒胭脂堿合成酶基因的終止子序列.

1.1.3 培養(yǎng)基配方 共培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；抗性愈傷組織篩選培養(yǎng)基：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素(Kan)+500 mg/L潮霉素(Cef)；生根培養(yǎng)基： 1/2 MS+250 mg/L Cef.以上所有培養(yǎng)基 pH值均為5.8，121 ℃高壓滅菌15 min，卡那霉素和頭孢霉素在滅菌后溫度降至60 ℃左右時(shí)于超凈工作臺加入.培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，光周期條件為16 h/8 h，光照強(qiáng)度為2 000 lx，其中共培為暗培養(yǎng)[8-9].

圖1 pCB3000-EDT1載體圖譜Figure1 Map of Vector pCB3000-EDT1

1.2 方法

1.2.1 丹參無菌苗的制備 將丹參種子用4% NaClO溶液浸泡5 min，再用30% H2O2溶液浸泡5 min，然后用無菌水清洗3遍，接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，3 d后開始發(fā)芽，分別取發(fā)芽14 d的葉片、葉柄和莖段作為外植體.

1.2.2 農(nóng)桿菌的活化與外植體的浸染、轉(zhuǎn)化、篩選、再生 挑取單菌落,接種于液體培養(yǎng)基中加入Kan 50 mg/L及利福平(rif)20 mg/L,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h.將菌液倒入無菌離心管中,離心5 min,棄上清,加入液體培養(yǎng)基稀釋.將外植體材料放入稀釋后的菌液中浸染15 min,取出用無菌濾紙吸去菌液.將外植體放入共培培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)48 h.

將共培48 h后的外植體轉(zhuǎn)接于含有卡那霉素和頭孢霉素的篩選培養(yǎng)上繼續(xù)培養(yǎng).每15 d更換1次培養(yǎng)基.待再生芽長到1 cm左右時(shí),轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根.生根后的再生株經(jīng)PCR檢測并移栽到溫室花盆中.

1.2.3 不同外植體的轉(zhuǎn)化效率比較 以葉片(0.5 cm×0.5 cm)、葉柄(1 cm)、莖段(1 cm)為外植體，分別選50個(gè)外植體在1.2.2的條件下進(jìn)行浸染轉(zhuǎn)化，3次重復(fù)，分別于共培后30 d、45 d和60 d統(tǒng)計(jì)分化出再生芽的外植體數(shù).比較3種外植體的轉(zhuǎn)化效率.

1.2.4 菌液濃度和浸染時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率比較 收集D600=0.6時(shí)的農(nóng)桿菌,用MS液體培養(yǎng)基分別稀釋至菌濃度為D600=0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6的濃度梯度,設(shè)計(jì)不同的浸染時(shí)間(10、15、20、30、60 min)進(jìn)行浸染處理.共培養(yǎng)48 h后,在含卡那霉素50 mg/L的培養(yǎng)基上篩選,每15d更換一次培養(yǎng)基,統(tǒng)計(jì)外植體分化率.

1.2.5 轉(zhuǎn)EDT1基因丹參再生株的PCR檢測 取少量丹參再生株葉片(T0)與受體對照(CK)葉片，利用CTAB法提取總 DNA.EDT1基因的擴(kuò)增引物為P1：5′-AACTGGTTGTGGACCTTTTGGT-3′和 P2：5′-TCGACAAGTGCCATAGCATTCA -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為557 bp.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性30 s；62 ℃退火30 s；72 ℃，延伸60 s；40個(gè)循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測[10-13].

1.2.6 轉(zhuǎn)EDT1基因丹參再生株的抗旱性鑒定 獲得的轉(zhuǎn)基因丹參T0代植株及其受體對照移栽到花盆中，成活后停止?jié)菜?0 d后復(fù)水，比較復(fù)水后轉(zhuǎn)EDT1基因丹參與其受體對照生長情況，初步鑒定轉(zhuǎn)EDT1基因丹參的抗旱性.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體的轉(zhuǎn)化效率比較

以丹參葉柄、葉片和莖段作為外植體進(jìn)行比較，不同外植體的分化情況不同，以葉柄作為外植體分化和再生都相對較好(圖2).對不同外植體浸染培養(yǎng)不同時(shí)間的分化率和最終成苗數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表1所示，不同丹參外植體的轉(zhuǎn)化效率差異顯著，分化速度也有明顯差異.培養(yǎng)30 d后，葉柄外植體與莖段差異顯著(P<0.05)，與葉片差異不顯著(P<0.05)，葉片與莖段之間差異不顯著.培養(yǎng)45d后葉柄與葉片和莖段之間差異極顯著，葉片與莖段之間差異不顯著.培養(yǎng)60 d后，葉柄與葉片和莖段之間差異極顯著，葉片與莖段之間差異不顯著.最終成活再生苗數(shù)葉柄與葉片和莖段之間差異極顯著，葉片與莖段之間差異不顯著.以丹參葉柄作為外植體分化率高、分化速度快，比葉片和莖段有明顯的優(yōu)勢.而且以葉柄作為外植體相對于葉片操作更方便，后期培養(yǎng)更易于消除農(nóng)桿菌污染，減少細(xì)菌污染幾率.

A、B、C：以葉片為外植體轉(zhuǎn)化丹參；D、E、F：以葉柄為外植體轉(zhuǎn)化丹參；G、H、I：以莖段為外植體轉(zhuǎn)化丹參.A、B、C：Transforming Salvia miltiorrhiza with leaves as explants；D、E、F：Transforming Salvia miltiorrhiza with leaflets as explants;G、H、I：Transforming Salvia miltiorrhiza with stem segments as explants.圖2 不同外植體轉(zhuǎn)化丹參比較Figure 2 Comparison of Salvia miltiorrhiza transformation with different exoplants

表1 不同外植體的轉(zhuǎn)化效率比較Table 1 Comparison of conversion efficiency of different explants

2.2 轉(zhuǎn)EDT1基因丹參植株的獲得

經(jīng)種子消毒處理獲得的丹參無菌苗14 d葉齡葉柄切成1 cm左右的小段，經(jīng)農(nóng)桿菌浸染、共培48 h后,轉(zhuǎn)移到含50 mg/LKan的篩選培養(yǎng)基上，每15 d繼代一次，經(jīng)篩選共獲得44個(gè)克隆的142個(gè)陽性再生株(圖 3).

A:丹參葉片農(nóng)桿菌浸染；B:丹參葉片浸染后誘導(dǎo)愈傷和出芽；C：丹參莖段農(nóng)桿菌浸染；D:丹參莖段浸染后誘導(dǎo)愈傷和出芽；E:丹參葉柄農(nóng)桿菌浸染；F：丹參葉柄浸染后誘導(dǎo)愈傷和出芽；G：丹參再生株獲得；H:丹參再生株獲得.A：Agrobacterium tumefaciens of Salvia miltiorrhiza leaves；B：Induction of callus and budding of Agrobacterium tumefaciens Salvia miltiorrhiza leaves；C：Agrobacterium tumefaciens in stem segment of Salvia miltiorrhiza；D：Induction of callus and budding of Salvia miltiorrhiza stems after soaking；E：Salvia miltiorrhiza petioles impregnated with Agrobacterium tumefaciens；F：Induction of callus and budding of Salvia miltiorrhiza after soaking；G：Obtaining of Salvia miltiorrhiza regeneration plant；H：Obtaining of Salvia miltiorrhiza regeneration plant.圖3 轉(zhuǎn)EDT1基因丹參的獲得Figure 3 Acquisition of EDT1gene Salvia miltiorrhiza

2.3 農(nóng)桿菌液濃度及浸染時(shí)間對丹參轉(zhuǎn)化效率的影響

如圖4所示結(jié)果表明，農(nóng)桿菌濃度和浸染時(shí)間對丹參的轉(zhuǎn)化效率有顯著影響.相同農(nóng)桿菌液濃度不同浸染時(shí)間比較結(jié)果表明，浸染15 min與其它浸染時(shí)間比較，分化率顯著提高.相同浸染時(shí)間不同農(nóng)桿菌液濃度的轉(zhuǎn)化率比較結(jié)果表明，在所有的浸染時(shí)間中，農(nóng)桿菌液濃度D600=0.4時(shí)分化率顯著高于其它濃度.根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇農(nóng)桿菌液濃度D600=0.4，浸染時(shí)間15 min作為最適宜的浸染條件.

圖4 農(nóng)桿菌液濃度及浸染時(shí)間對丹參分化率的影響Figure 4 Effect on differentiation rate of Salvia miltiorrhiza of Agrobacterium tumefaciens concentration and soaking time

2.4 轉(zhuǎn)EDT1基因丹參再生株的PCR檢測

PCR檢測結(jié)果表明，共獲得44個(gè)克隆的142個(gè)陽性再生株.142個(gè)陽性株均擴(kuò)增出大小相同，長度為 557 bp的目標(biāo)條帶，空白對照和受體對照均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(圖5)，證明外源基因EDT1已導(dǎo)入受體丹參基因組 DNA中.

2.6 轉(zhuǎn)EDT1基因丹參再生株的抗旱性鑒定

經(jīng)PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因丹參植株，經(jīng)擴(kuò)繁后，移栽到網(wǎng)室花盆中.為鑒定轉(zhuǎn)基因丹參植株的抗旱性，選取4個(gè)陽性再生株系與其受體對照，干旱脅迫 20 d，當(dāng)轉(zhuǎn)基因株系與對照均表現(xiàn)萎蔫，這時(shí)進(jìn)行復(fù)水處理，復(fù)水后轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)生長，受體對照不能恢復(fù)生長.表明轉(zhuǎn)EDT1基因丹參比其受體對照抗旱性增強(qiáng)(圖6).

M：mark2000;1:空白對照；2：受體對照；3～144：轉(zhuǎn)EDT1基因丹參陽性株.M：mark2000;1:Black control；2：Pecep control；3～144：Positive strain of transferring EDT1 gene Salvia miltiorrhiza.圖5 轉(zhuǎn)EDT1基因丹參的PCR檢測Fgure 5 PCR detection of transferring EDT1gene Salvia miltiorrhiza

A為受體對照丹參植株，B、C、D、E為轉(zhuǎn)EDT1基因丹參植株；1為干旱脅迫前的轉(zhuǎn)EDT1基因丹參植株及受體對照丹參植株；2為干旱20d后的轉(zhuǎn)EDT1基因丹參植株及受體對照丹參植株；3為復(fù)水后的轉(zhuǎn)EDT1基因丹參植株及受體對照丹參植株.A.Receptor of EDT1gene Salvia miltiorrhiza，B、C、D、E.EDT1 gene Salvia miltiorrhiza;1.EDT1 gene Salvia miltiorrhiza plants and receptor plants before drought Stress;2.EDT1 gene Salvia miltiorrhiza plants and receptor plants of 20 days after drought stress;3.EDT1 gene Salvia miltiorrhiza plants and receptor plants after rewater.圖6 轉(zhuǎn)EDT1基因丹參抗旱性鑒定Figure 6 Identification of drought resistance of EDT1gene Salvia miltiorrhiza

3 討論

丹參的遺傳轉(zhuǎn)化體系創(chuàng)建，已取得一些成熟的研究成果.常用的轉(zhuǎn)化方法是以葉片和葉柄為外植體，采用MS+6-BA+NAA作為誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基,并以頭孢霉素作為除菌培養(yǎng)抗生素.本研究比較了以葉柄、葉片和莖段分別作為外植體的轉(zhuǎn)化效率，以及不同農(nóng)桿菌液濃度和浸染時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響，最終確定了以14 d葉齡葉柄為外植體，農(nóng)桿菌液濃度D600=0.4 浸染15 min，MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本條件的丹參轉(zhuǎn)化體系[14-17].

丹參遺傳轉(zhuǎn)化受基因型限制不明顯[18-20],報(bào)道的受體品系也比較多.目前報(bào)道的丹參轉(zhuǎn)化以葉盤為外植體的較多，多數(shù)研究者的研究結(jié)果表明葉片比葉柄轉(zhuǎn)化效率更高，而上海師范大學(xué)周偉的研究表明，28 d葉齡的丹參葉柄比葉片的分化效率更高，更容易成芽[21-24].本研究以14 d葉齡的葉柄、莖段和葉片為外植體，結(jié)果表明以葉柄為外植體比葉片和莖段有明顯優(yōu)勢，表現(xiàn)在分化率高，分化速度較快.不同外植體的分化效率可能與丹參葉齡有關(guān)，當(dāng)?shù)⑷~齡在7～14 d時(shí)，葉片的分化效率較高，當(dāng)葉齡超過14d至28d甚至更長時(shí)，葉柄的分化效率較高.無論葉齡大小，以葉柄為外植體在浸染過程中更易于操作，相比之下，葉片難以剪切，放置時(shí)間稍長會萎蔫卷曲.在后期培養(yǎng)中，葉片四周容易翹起脫離培養(yǎng)基，造成農(nóng)桿菌清除困難[25-27].

EDT1基因是中國科技大學(xué)向成斌教授從擬南芥耐旱突變體edt1中分離克隆得到的，在野生型擬南芥和煙草中過表達(dá)EDT1基因不但顯著增強(qiáng)抗旱性與改良根系構(gòu)型,還顯著提高光合效率和水分利用率[28].EDT1基因被轉(zhuǎn)入玉米、水稻、棉花中，獲得了抗旱性顯著提高的種質(zhì)材料[29].在干旱脅迫下，本研究獲得的轉(zhuǎn)EDT1基因再生丹參植株葉片及根系生長明顯優(yōu)于受體對照，抗旱能力明顯提高.