小麥-簇毛麥易位系V832抗條銹性遺傳分析及細(xì)胞學(xué)鑒定

盧濤,楊艷,徐志,馬東方,,尹軍良

( 1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 荊州 434025;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610066)

由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici) 引起的小麥條銹病在我國西北麥區(qū)、長江中下游麥區(qū)、華北麥區(qū)、西南麥區(qū)等地普遍發(fā)生，尤其是西北地區(qū)的小麥條銹病最重[1-2].雖然化學(xué)藥劑防治可以及時(shí)控制該病害，但是有違我國目前提倡的“減藥”方針.而且小麥條銹菌極易通過有性生殖產(chǎn)生新的毒性更強(qiáng)的生理小種，加之大面積推廣小麥品種的抗感病程度不同或抗源的單一化導(dǎo)致條銹病常年大范圍發(fā)生和大區(qū)域流行[3-4]，已嚴(yán)重影響我國糧食安全.

截至2019年，國際上正式命名的抗條銹基因已有81個(gè)，即Yr1～Yr81[5-6].其中Yr5、Yr8、Yr9、Yr15、Yr17、Yr19、Yr24、Yr26、Yr28、Yr35、Yr36、Yr37、Yr38、Yr40、Yr42來自于小麥的稀有種或近緣種屬，其余抗條銹病基因均來自普通小麥.除了上述已經(jīng)命名的基因以外，還有一些未被正式命名的基因.如本課題組暫命名的抗條銹病基因YrR39、YrBai、YrH9017、YrH9015、YrS1和YrS2等[7-10].聚合全生育期和成株期抗條銹基因的小麥可達(dá)到持久抗條銹的特點(diǎn)[11].自1950年以來，我國已經(jīng)發(fā)生了7次大規(guī)模小麥抗條銹“喪失”事件[12].因此，迫切需要鑒定新的抗條銹小麥品種(系)，加速持久抗病小麥的選育.

小麥野生近緣植物中含有豐富的優(yōu)良抗逆基因，利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)將外緣抗病基因?qū)肫胀ㄐ←?，對改良普通小麥的抗性，累積抗病遺傳增益具有重要戰(zhàn)略意義[13-14].簇毛麥(Haynaldiavillosa2n=14VV)是小麥亞族簇毛麥屬的一年生二倍體物種，對小麥全蝕病、小麥條斑病和葉枯病等具有良好抗性.傅杰等[15]已成功將簇毛麥的這些優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←溨?，形成一系列的小麥新品?本研究利用我國流行的條銹菌小種(菌系)對簇毛麥易位系V832進(jìn)行抗性鑒定、遺傳分析和細(xì)胞學(xué)分析，以明確V832是否攜帶小麥抗條銹病基因并鑒定抗病基因來源以及細(xì)胞學(xué)特性，為進(jìn)一步利用簇毛麥中優(yōu)良抗條銹病基因提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥V832、銘賢 169、簇毛麥、普通小麥7182，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院抗病遺傳研究室提供.以銘賢169為母本，與V832進(jìn)行雜交獲得F1、F2、F3、BC1群體，條銹菌流行小種和菌系Su11-4、Su11-7、CYR23、CYR29、CYR32、CYR33及CYR34，由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子真菌與基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 試驗(yàn)方法

所有供試小麥種子先用1%的H2O2浸泡10 min，蒸餾水清洗后浸種24 h，待種子萌發(fā)后播種，置于數(shù)控溫室中培育.待小麥幼苗長至二葉期接種第一片葉，用手指蘸清水輕搓葉片表面以脫去蠟質(zhì)層，將新鮮條銹菌夏孢子涂抹于小麥葉片正面，接種后將小麥放入暗箱(10 ℃、相對濕度100%)培養(yǎng)，24 h后取出，放置溫室繼續(xù)培養(yǎng)，溫度控制在15～17 ℃(晝)/10～12 ℃(夜)，每日光照15 h，光照強(qiáng)度 729 mol/(m2·s)，相對濕度75%～80%[16].

1.3 調(diào)查與統(tǒng)計(jì)分析

待感病的銘賢169充分發(fā)病時(shí)調(diào)查接種小麥的發(fā)病程度.反應(yīng)型分為11級，分別是：0、0;、0;+、1、1+、2、2+、3-、3、3+、4，發(fā)病程度從低到高劃分，其中0為免疫，4為小麥葉片著生大量條銹菌夏孢子堆且無褪綠斑，劃分0～2+型為抗病，3-～4為感病.據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病親本、感病親本、F1、BC1、F2和F2∶3代接種后的反應(yīng)型[17].統(tǒng)計(jì)抗病和感病數(shù)目，計(jì)算雜交群體F2的抗感分離比例以及F2∶3家系的分離比例，并用χ2(≤χ20.05)和P值進(jìn)行分離比例的適合度檢驗(yàn)，確定最適分離比率，進(jìn)而明確小麥V832含有的抗病基因數(shù)目[18].

1.4 基因組原位雜交(GISH)

將小麥V832種子放置在無菌水中培養(yǎng)，剪取1.5 cm新鮮根尖，放置于冰水中12 h，再固定于卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中24 h，蒸餾水清洗3遍后在45%冰醋酸中壓片，液氮冷凍揭片后置于-20 ℃保存.用地高辛(Roche,Germany)標(biāo)記華山新麥草總DNA，與制備好的H1684雜交后加抗體地高辛-熒光素，用含適量碘化丙錠的抗褪色劑封片，最后置于熒光顯微鏡觀察染色體構(gòu)型并照相[19].

2 結(jié)果與分析

2.1 V832苗期的抗性鑒定及抗性來源分析

以銘賢169為感病對照，用條銹菌生理小種Su11-4、Su11-7、CYR23、CYR29、CYR32、CYR33及CYR34對V832進(jìn)行苗期抗條銹性接種測試.結(jié)果表明，V832對所有參與測試小種表現(xiàn)為免疫到高抗(表1).因此，V832是一個(gè)優(yōu)良抗小麥條銹病的抗源.

用Su11-4、Su11-7、CYR23、CYR29、CYR32、CYR33及CYR34對簇毛麥和7182進(jìn)行了苗期抗條銹性接種測試.結(jié)果顯示，V832的抗病反應(yīng)型小麥與簇毛麥極為接近，為免疫到高抗( IT 0～0;)；而7182與銘賢169一致( IT 3+～4)(表1).據(jù)此推斷，V832對條銹病的抗性極有可能來自于簇毛麥.

表1 V832及其親本苗期的抗條銹性鑒定結(jié)果Table 1 Evaluation of resistance of V832 and its parents to Puccinia striiformis in seedling stage

2.2 V832 苗期抗病性遺傳分析

結(jié)果顯示，所有雜交群體的F1代均表現(xiàn)抗病反應(yīng)型.接種Su11-7的BC1代群體中，12株抗病，14株感病，符合1∶1分離比(χ2=0.04，P=0.69)；F2群體中，102株抗病，31株感病，符合3∶1的分離比(χ2=0.12，P=0.65)；由F2獲得的F2∶3代家系中純抗家系36個(gè)，抗感分離家系66個(gè)，感病家系31個(gè)，符合1∶2∶1分離比(χ2=0.38，P=0.83).結(jié)果表明，V832對Su11-7的抗病性是由1對顯性基因控制.

接種CYR32的BC1代群體中，14株抗病，11株感病，符合1∶1分離比(χ2=0.16，P=0.55)；F2群體中，168株抗病，52株感病，符合3∶1的分離比(χ2=0.15，P=0.64)；F2∶3代家系中純抗家系61個(gè)，抗感分離家系105個(gè)，感病家系50個(gè)，符合1∶2∶1分離比(χ2=1.29，P=0.83).結(jié)果表明，V832對CYR32的抗病性是由1對顯性基因控制.

表2 V832對Su11-7和CYR32的抗條銹病遺傳分析Table 2 Inheritance analysis of V832 to Pst races of Su11-7 and CYR32

2.3 V832的細(xì)胞學(xué)特征

以簇毛麥總DNA為探針，對V832 進(jìn)行了基因組原位雜交(GISH)試驗(yàn).結(jié)果表明，V832含有42條染色體，并有一對染色體片段呈現(xiàn)簇毛麥DNA信號(圖1).這表明V832含有來自簇毛麥的染色體或大的染色體片段.

圖1 V832的原位雜交結(jié)果Figure 1 Insitu hybridization analysis of line V832

3 討論

根據(jù)課題組多年田間鑒定結(jié)果，易位系V832具有良好的全生育期抗病性.本研究對V832的抗條銹性鑒定結(jié)果表明，V832對我國目前流行的條銹菌小種具有優(yōu)良的抗病性，推測抗病基因可能來源于簇毛麥.V832對Su11-7和CYR32的抗、感病的分離比例符合3∶1的分離模式，說明衍生于簇毛麥的小麥新抗源V832對Su11-7和CYR32分別由一對顯性基因控制.但是V832對Su11-7和CYR32的抗病基因是否相同，以及該基因在V832染色體上的具體位置有待通過分子標(biāo)記進(jìn)一步確定.以便后續(xù)挖掘與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記用于分子輔助育種.

上世紀(jì)70年代中期起，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室將簇毛麥的多種抗病基因?qū)肫胀ㄐ←?研究者選育了一批兼抗白粉病和條銹病的小麥-簇毛麥異附加系、代換系和易位系[20].90年代末井金學(xué)等[21]用當(dāng)時(shí)的小麥條銹病菌優(yōu)勢小種CYR29、CYR30和CYR31測定了簇毛麥與小麥的雜交后代的抗條銹性，結(jié)果表明簇毛麥含有寶貴的抗條銹基因，并認(rèn)為簇毛麥的抗條銹基因可轉(zhuǎn)移至普通小麥中，并且此類基因具有較強(qiáng)的傳遞性.進(jìn)入21世紀(jì)以來，侯璐等[22]對兩個(gè)小麥-簇毛麥易位系進(jìn)行抗條銹性遺傳檢測，表明小簇麥易位系V9128-1至少含有兩對抗條銹基因，V9129-1中至少含有3對抗條銹病基因.尹軍良等[23]對小麥-簇毛麥易位系中的V9125-3和V9125-4進(jìn)行抗條銹性遺傳分析，表明V9125-3和V9125-4都至少含有兩對抗條銹基因.這5個(gè)易位系(V832、V9128-1、V9129-1、V9125-3和V9125-4)抗條銹基因的異同必須通過等位性分析加以確認(rèn).本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)將開展相關(guān)工作，以便于抗條銹基因的精準(zhǔn)利用.周新力等[24]通過對小麥-簇毛麥易位系V9128-1進(jìn)行抗條銹遺傳分析和分子標(biāo)記，表明V9128-1對CYR30的抗條銹性是由一對顯性基因控制，并將YrV1定位于3BS染色體上.侯璐等[25]通過對小麥-簇毛麥易位系V9128-3進(jìn)行抗條銹遺傳分析和分子標(biāo)記，表明V9128-3對Su11-4的抗條銹性是由一對顯性基因控制，并將YrHV定位于2AL染色體上.王睿等[26]通過對小麥-簇毛麥易位系V9125-2進(jìn)行抗條銹遺傳分析和分子標(biāo)記，表明V9125-2對CYR29的抗條銹性是由一對顯性基因控制，并將YrWV定位于7DS染色體上，而且抗病基因YrWV不同于YrHV和YrV1.綜上，已育成的小麥-簇毛麥易位系中含有豐富的抗條銹基因，且為質(zhì)量遺傳，作為抗源在小麥抗銹育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值.利用外源抗病基因防治條銹病在我國小麥生產(chǎn)中也取得了良好的實(shí)踐效果，如小偃6號[27]、中梁22[28]等.本研究發(fā)現(xiàn)的優(yōu)異抗病資源V832對多個(gè)條銹菌小種均具有良好抗病性，可能含有多個(gè)抗病基因，因此具有很好的利用價(jià)值.

4 結(jié)論

本研究通過基因組原位雜交(GISH)證實(shí)了V832含有來自簇毛麥的染色體片段，而且外源染色體片段長達(dá)整個(gè)染色體短臂，推測V832中的抗條銹病基因來源于簇毛麥.小麥易位系V832可以通過雜交將優(yōu)良基因?qū)肫渌髟孕←溒贩N中，加之V832與普通小麥7182的農(nóng)藝性狀接近，所以V832在育種上的直接利用更具可行性.尤其是在新的條銹菌小種不斷出現(xiàn)的形勢下，綜合利用簇毛麥中的抗條銹病基因?qū)ξ覈←溈共∮N具有重要意義.