藏藥佐太和甲基汞對神經(jīng)細胞Neuro-2a毒性的差異比較

夏政華，李岑，畢宏濤，耿盧婧，杜玉枝，魏立新

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，藏藥研究重點實驗室，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.青海省藏藥藥理學(xué)與安全性評價重點實驗室，青海 西寧 810008)

佐太是水銀等原料經(jīng)炮制后制成的礦物藥[1-2]，藏醫(yī)認為將其加入到藥物中具有“減毒增效”的功能[3]，在治療中風(fēng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝膽胃腸疾病和腫瘤等方面具有獨特的功效[4]，然而，由于近年來環(huán)境中的汞污染受到人們的持續(xù)關(guān)注，尤其是甲基汞極易透過血腦屏障對神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)損傷[5]，造成“汞化合物等于神經(jīng)毒物”的認知，引起人們對含汞藏藥的恐慌，極大限制了含佐太藏藥的臨床應(yīng)用.

盡管現(xiàn)代理化分析表明佐太中約含54.5%的β-HgS，這些β-HgS是微粒直徑約為200～700 nm的納米藥物[6-7]，并且通過對含佐太藥物使用的臨床監(jiān)測和動物試驗，已初步證實該藥對人體肝腎功能是安全的，肝腎等代謝器官中的汞蓄積對試驗動物無明顯毒副作用[8-10].此外，臨床應(yīng)用表明，含佐太的藥物能治療神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，如阿爾茨海默癥[11]，而且前期研究發(fā)現(xiàn)佐太對抑郁模型小鼠的抑郁狀態(tài)具有良好的改善作用[12]，這些研究結(jié)果均提示佐太的藥理活性作用部位可能是神經(jīng)系統(tǒng).但是，目前對佐太和甲基汞的毒性差異研究主要集中在肝腎毒性、藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運體基因的表達等方面[13-15]，缺乏在神經(jīng)毒性差異方面的研究，無法消除人們對含佐太藏藥治療神經(jīng)系統(tǒng)類疾病的質(zhì)疑.

為了探究佐太和甲基汞對神經(jīng)細胞的毒性區(qū)別，進一步提供佐太用藥的安全性依據(jù)，本研究選用小鼠神經(jīng)瘤母細胞Neuro-2a，通過測定用藥后細胞存活率、細胞形態(tài)、細胞凋亡率、凋亡基因的表達等指標(biāo)，以期能系統(tǒng)地評價佐太和甲基汞對神經(jīng)細胞Neuro-2a凋亡的影響差異.

1 儀器與材料

1.1 藥物

佐太(西藏藏醫(yī)院藏藥廠)；MeHg(美國Sigma公司)；小鼠腦神經(jīng)瘤母細胞Neuro-2a(中國科學(xué)院細胞庫).

1.2 儀器

奧林巴斯熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；多功能酶標(biāo)儀(珀金埃爾默企業(yè)管理上海有限公司)；FlowSight流式細胞儀(美國默克公司)；ETC811基因擴增儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)； ViiATM7實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技中國有限公司).

1.3 主要試劑

磺基羅丹明 B(sulforhodamine B，SRB)(美國Sigma公司)；蘇木素伊紅染色試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)有限公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(大連Takara公司).

2 試驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將Neuro-2a細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液 (100×)的MEM 培養(yǎng)液中，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的Neuro-2a細胞用 0.25% 胰酶-EDTA 消化傳代，胰酶消化2～3 min后收集細胞，8 000個/孔接種于96孔板或25萬/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)試驗步驟.

2.2 分組和給藥

試驗分組為：空白對照組(Control)，佐太組(Zuotai，1.83 mg/L，含汞1 mg/L)，甲基汞組(MeHgCl，1.25 mg/L，含汞1 mg/L)，給藥后培養(yǎng)時間分別為6、12、24 h，培養(yǎng)結(jié)束后進行細胞存活率、細胞形態(tài)、凋亡率、凋亡基因表達的檢測.試驗藥物的配制液均為PBS，佐太組為懸浮液給藥[16].

2.3 細胞存活率

采用磺基羅丹明 B 法(sulforhodamine B，SRB)法檢測細胞存活率，相比于傳統(tǒng)的MTT法，SRB法不僅具有操作簡便、靈敏的特點，而且測量結(jié)果不受時間影響[17].按照2.1方法在細胞培養(yǎng)結(jié)束后，倒掉細胞培養(yǎng)液后每孔加入100 μL預(yù)冷的10% TCA，4 ℃固定后純水清洗5次，每孔加入100 μL SRB作用20 min，1% 冰乙酸沖洗5次后干燥，加入150 μL/孔Tris-HCl(10 mmol/L)，置于振板器20 min，酶標(biāo)儀560 nm測定OD值.按照下式計算細胞存活率.

細胞存活率(%)=(給藥組OD值/空白對照組OD值)×100%

2.4 細胞形態(tài)

按照2.1方法在細胞培養(yǎng)結(jié)束后，6孔板中取出細胞爬片，PBS漂洗3次，95%的乙醇固定20 min后蘇木素染色10 min，自來水沖洗10 min去除多余染色液，伊紅染色30～120 s，70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇梯度脫水，中性樹脂封片后進行細胞形態(tài)觀察.

2.5 細胞凋亡率

使用AnnexinV-FITC和PI雙染法檢測藥物細胞孵育后的凋亡情況[18-19].按照2.1方法在細胞培養(yǎng)結(jié)束后，PBS洗滌細胞一次，消化后收集細胞于1 000g離心5 min，棄上清PBS重懸后計數(shù)，取10萬細胞1 000g離心5 min，棄上清后加入195 μL Annexin V- FITC結(jié)合液重懸細胞，加入5 μL Annexin V- FITC、0 μL碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光孵育15 min后流式細胞儀檢測凋亡情況.

2.6 凋亡基因、炎癥因子基因檢測

按照2.1方法在細胞培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，1 mL/孔的TRIzol提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用目標(biāo)引物擴增cDNA后檢測凋亡基因、炎癥因子基因的表達情況.引物序列見表1.

表1 實時熒光定量PCR引物列表Table 1 Primer sequences for RT-PCR

2.7 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果與分析

3.1 細胞存活率檢測

與空白組相比，隨著孵育時間的增加(6、12、24 h)，佐太組的細胞存活率分別為(100±0.032)%、(99.4±0.033)%、(96.8±0.102)%，甲基汞組的細胞存活率分別為(97.1±0.082)%、(66.1±0.147)%、(26.3±0.069)% (圖1)，甲基汞對于Neuro-2a細胞存活率的影響遠大于佐太.

3.2 細胞形態(tài)觀察

HE染色表明，3個孵育時間下(6、12、2 4h)，空白組的Neuro-2a細胞呈不規(guī)則多邊形，細胞邊界清晰，形態(tài)良好(圖2-A、2-D、2-G).與空白組相比，佐太組的細胞形態(tài)未有明顯變化(圖2-B、2-E、2-H)，而甲基汞組的細胞逐漸固縮且出現(xiàn)絮狀物，細胞形態(tài)受破壞程度逐漸加劇(圖2-C、2-F、2-I)，佐太和甲基汞對細胞形態(tài)的破壞性與細胞存活率的檢測結(jié)果一致.

與空白組相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.Compared with the control group,*** P<0.001,** P<0.01,*P<0.05.圖1 佐太和甲基汞對Neuro-2a細胞存活率的影響(n=6)Figure 1 Effect of Zuotai and MeHgCl on the cell viability of Neuro-2a (n=6)

圖2 佐太和甲基汞對Neuro-2a細胞形態(tài)的影響(HE染色，400×)Figure 2 Effect of Zuotai and MeHgCl on Neuro-2a cell morphology (HE staining,400×)

3.3 流式法檢測細胞凋亡率

AnnexinV-FITC和PI雙染表明，與空白組相比，佐太組的細胞凋亡率在12 h和24 h顯著增加，而甲基汞組的細胞凋亡率隨孵育時間的增加均極顯著增加，且均遠高于佐太組.孵育6 h時甲基汞組的凋亡率比佐太組高24.5%；孵育12 h時甲基汞組的凋亡率為46.9%，佐太組為17.4%；孵育24 h時甲基汞組的凋亡率是佐太組的2.52倍(圖3-A).結(jié)果與細胞存活率、細胞形態(tài)結(jié)果一致.圖3-B是細胞儀檢測細胞凋亡的可視化圖，圖4是Annexin V-FITC/PI法檢測佐太和甲基汞對Neuruo-2a細胞凋亡率影響的流式圖.

圖4 佐太和甲基汞對Neuruo-2a細胞凋亡率影響的流式圖(Annexin V-FITC/PI法)Figure 4 Flow cytometric analysis of the effects of Zuotai and MeHgCl on neuruo-2a cell apoptosis(Annexin V-FITC/PI)

3.4 Caspase家族基因表達

RT-PCR檢測表明，孵育時間為24 h時，甲基汞組Caspase-3基因表達量比空白組和佐太組分別高21.9%、22.3%，Caspase-9基因表達量比空白組和佐太組分別高239%、232%(圖5).Caspase家族基因表達結(jié)果與細胞凋亡率并不完全一致，可能是由于基因表達與表型的差異性所致，還需要Westen blot等方法進一步的檢測.

與空白組相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.Compared with the Control group,***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.圖3 佐太和甲基汞對Neuro-2a細胞凋亡率的影響 (n=3)Figure 3 Effect of Zuotai and MeHgCl on the apoptosis rates in Neuro-2a (n=3)

與空白組相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.Compared with the control group,***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.圖5 佐太和甲基汞對Neuro-2a細胞Caspase家族基因表達的影響(n=9)Figure 5 Effect of Zuotai and MeHgCl on the expressions of Caspase-related genes in Neuro-2a (n=9)

3.5 線粒體相關(guān)凋亡基因表達

RT-PCR檢測表明，隨著孵育時間的增加，佐太組Bcl-2/Bax的比值并未有明顯變化，而甲基汞組Bcl-2/Bax的比值分別為86.9%(6 h)、60.8%(12 h)、48.5%(24 h)，說明細胞趨于凋亡狀態(tài)(圖6).

與空白組相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.Compared with the control group,***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.圖6 佐太和甲基汞對Neuro-2a細胞線粒體凋亡相關(guān)基因表達的影響(n=9)Figure 6 Effect of Zuotai and MeHgCl on the expressions of mitochondrial apoptosis-related genes in Neuro-2a (n=9)

3.6 炎癥因子相關(guān)基因表達

RT-PCR檢測表明，與空白組相比，佐太組在孵育時間為6 h和12 h時炎癥因子的表達并未有明顯變化，但是隨著孵育時間增加至24 h，IL-6和TNF-α分別增加了11.3倍和1.61倍.甲基汞組在孵育的3個時間點，IL-6、IL-1β、TNF-α的表達均顯著增加，如在2 h時IL-6、IL-1β、TNF-α的表達分別增加了138倍、33.5倍、218倍.雖然甲基汞和佐太均能引起炎癥因子基因表達的增加，但是甲基汞的影響遠遠大于佐太組.

4 討論

為了探究藏藥佐太和甲基汞對神經(jīng)細胞Neuro2a凋亡情況的影響差異，采用SRB法測定細胞存活率、HE染色觀察細胞形態(tài)、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，實時熒光定量PCR檢測Caspase家族基因、線粒體凋亡相關(guān)基因、炎癥因子基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在含汞量相同時，甲基汞對神經(jīng)細胞Neuro-2a的凋亡影響遠大于佐太.

與空白組相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.Compared with the Control group,***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05.圖7 佐太和甲基汞對Neuro-2a細胞炎癥因子基因表達的影響(n=9)Figure 7 Effect of Zuotai and MeHgCl on the expressions of inflammatory cytokines genes in Neuro-2a (n=9)

通過測定細胞存活率，同時結(jié)合細胞形態(tài)學(xué)觀察和細胞凋亡率的檢測，發(fā)現(xiàn)隨著孵育時間的增加，甲基汞組的細胞存活率逐漸降低，細胞形態(tài)受到嚴重破壞，而佐太組細胞的存活率并無明顯變化，形態(tài)也未產(chǎn)生明顯改變.甲基汞組的細胞凋亡率隨孵育時間的增加而顯著增加，且均高于佐太組，細胞凋亡率的變化與細胞存活率和細胞形態(tài)學(xué)的差異性一致.

Caspase家族在細胞凋亡的分子網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位[20]，是多條凋亡通路的匯聚點，是執(zhí)行凋亡的最終途徑，檢測Caspase家族基因的表達可以進一步表明細胞的凋亡狀態(tài)[21].RT-PCR檢測結(jié)果顯著，甲基汞組的Caspase家族基因Caspase-3和Caspase-9基因表達增加，佐太對Caspase家族基因的表達無顯著影響.細胞的凋亡通路會還受到多種基因和蛋白的調(diào)控，如線粒體凋亡通路，而線粒體凋亡通路中的Bc1-2家族的基因表達和調(diào)節(jié)是影響細胞凋亡的重要因素之一[22]，Bcl-2家族中的促凋亡成員(如Bax、Bak)和抑凋亡成員(如Bcl-2)通過相互作用影響細胞的凋亡狀態(tài)，其中Bcl-2與Bax的比值變化是調(diào)節(jié)細胞凋亡狀態(tài)的關(guān)鍵因素[23].RT-PCR結(jié)果表明甲基汞組的Bcl-2/Bax比值隨孵育時間的增加而降低，表明細胞趨于凋亡狀態(tài)，而佐太組的Bcl-2/Bax比值并未有明顯變化.前期研究發(fā)現(xiàn)佐太和甲基汞結(jié)合蛋白能夠分別影響肥大細胞和神經(jīng)細胞炎癥因子的釋放[24-25]，因此檢測炎癥因子相關(guān)基因IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，RT-PCR結(jié)果顯示甲基汞組在孵育的3個時間點，IL-6、IL-1β、TNF-α的表達均極顯著增加，佐太雖然也能引起炎癥因子基因表達的增加，但遠低于甲基汞.

以上試驗結(jié)果表明不同孵育時間下，甲基汞均可以通過增加Caspase家族基因和炎癥因子基因表達，改變線粒體凋亡基因的表達比例來加劇神經(jīng)細胞Neuro-2a的凋亡狀態(tài)，使得細胞存活率降低，細胞凋亡率增加，改變細胞的正常形態(tài)，而等汞含量的佐太對神經(jīng)細胞Neuro-2a的凋亡狀態(tài)并無顯著影響，說明汞含量相同時藏藥佐太對神經(jīng)細胞Neuro-2a的毒性遠小于甲基汞.推測造成這種影響差異的決定性因素在于汞形態(tài)的不同，傳統(tǒng)含汞藥物中汞的形態(tài)均為硫化汞，例如中藥朱砂、印度藥Kajjali，佐太中汞的形態(tài)為β-HgS，與甲基汞相比在溶解度和腸道吸率等方面有顯著差異[26].已有研究表明含汞藥物中汞的形態(tài)可能是決定其藥效和毒性的關(guān)鍵因素[27]，而佐太中經(jīng)過特殊炮制后存在的汞可能是其藥效學(xué)的基礎(chǔ)[28].此外，由于佐太的顆粒性，在通過體外細胞系培養(yǎng)探索其毒性和藥理時，均采用懸浮液給藥方式[16,25]，本文中采用的是PBS配制佐太懸浮液，未考察汞溶出情況，在后續(xù)研究中應(yīng)結(jié)合汞溶出情況進一步深入探索.

通過以上探究證實藏藥佐太對神經(jīng)細胞Neuro-2a凋亡的影響遠小于甲基汞，提示藏藥佐太對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性不能只考慮汞元素而應(yīng)該充分考慮汞的形態(tài).本研究比較了藏藥佐太和甲基汞在神經(jīng)細胞毒性方面的差異性，為佐太安全性用藥和藥效學(xué)評價提供了新的依據(jù).