利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建SBNO2基因敲除細(xì)胞系及其功能研究

王妍鱈，任亭亭，孫躍峰，劉磊

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

草莓缺口同源物2(Strawberry Notch Homolog 2，SBNO2)在Notch信號通路及NF-κB通路過程中發(fā)揮重要功能[1-2].Notch基因編碼一類高度保守的細(xì)胞表面受體，調(diào)節(jié)多種生物的細(xì)胞發(fā)育過程.Notch信號影響多能干細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞邊界的形成等過程.研究表明，IL-10以STAT3依賴的方式刺激SBNO2基因在骨髓巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，SBNO2是IL-10下游抗炎作用通路上的重要組成部分，能夠抑制炎癥基因表達(dá)[3].在急性炎癥反應(yīng)過程中，IL-6也能夠刺激乳鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中SBNO2的表達(dá)[1].Karim等[3]發(fā)現(xiàn)SBNO2能夠顯著抑制NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄并認(rèn)為SBNO2可能與一系列其他蛋白相互作用，選擇性地抑制巨噬細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄.然而對于SBNO2基因在病毒感染過程中的作用機(jī)制研究很少，至今尚不清楚.

CRISPR/Cas9(clustered regularly interapaced short palin-dromic repeats/CRISPR-associated proteins 9)是一種由RNA核酸酶對目的基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)[4].RNA導(dǎo)向的CRISPR-Cas9系統(tǒng)已被應(yīng)用于多種細(xì)胞系和生物體的DNA和RNA編輯[5-6].能夠快速且高效地進(jìn)行表觀遺傳編輯，通過基因組位點(diǎn)敲除、修飾和突變，致使基因組表達(dá)受到調(diào)控，從而影響其功能[7].

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、 VP3和VP4)，其中VP1作為高度可變的結(jié)構(gòu)蛋白，G-H環(huán)內(nèi)有最具抗原性的位點(diǎn)[8-9].VP1編碼區(qū)的核苷酸序列因其在病毒附著、侵入、保護(hù)性免疫和血清型特異性等方面發(fā)揮重要作用，已被用于口蹄疫病毒毒株的遺傳特性鑒定以及分子流行病學(xué)研究[10-11].病毒基因組RNA進(jìn)入衣殼形成病毒粒子前體，再通過RNA觸發(fā)VP0發(fā)生裂解反應(yīng)，前病毒粒子最終被加工為成熟的病毒粒子，最終完整的病毒粒子從被感染的宿主細(xì)胞中釋放出來[9].本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得SBNO2基因敲除的BHK-21細(xì)胞系，驗(yàn)證該基因敲除后對口蹄疫病毒復(fù)制的影響，為進(jìn)一步闡明SBNO2對口蹄疫病毒調(diào)控的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ).通過深入探究FMDV感染的分子致病機(jī)制及其與宿主之間的相互作用，篩選出防控FMDV感染的新靶標(biāo)，可以為新型疫苗的研發(fā)提供重要的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、O型口蹄疫病毒(FMDV/O/BY/2010)和pSpCas9-puro-2A質(zhì)粒由家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自Takara公司；SBNO2抗體購自Santa Cruz公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、嘌呤霉素均購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和BCA蛋白定量分析試劑盒購自Thermo公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自Sigma公司.

PCR儀(Bio-Rad，美國)；蛋白電泳裝置(Bio-Rad，美國)；電熱恒溫水浴鍋(DK-8D)型(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國)；制冰機(jī)(Scotsman，美國)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠，中國)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國)；Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo，美國)；MX3000P 實(shí)時(shí)定量PCR儀(Agilent Technologies，美國).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Western Blot方法檢測BHK-21細(xì)胞感染FMDV后SBNO2基因表達(dá)水平 取3 mL 1.0×105個(gè)/mL的BHK-21細(xì)胞懸液鋪在60 mm的培養(yǎng)皿中.待細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行病毒感染，F(xiàn)MDV的TCID50為10-6.5/mL，按0.1 MOI的病毒量感染BHK-21細(xì)胞，分別于攻毒后的4、6 h收取細(xì)胞樣品.加入含1%蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細(xì)胞，制備蛋白樣品.用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，制備好的蛋白樣品進(jìn)行Western Blot檢測.一抗4 ℃過夜孵育， HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h.最后用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影和曝光.

1.2.2 sgRNA設(shè)計(jì)及CRISPR/Cas9重組載體的構(gòu)建 從NCBI中檢索倉鼠SBNO2基因序列(Gene ID:216161)，將序列輸入CRISPR在線設(shè)計(jì)軟件(http://tools.genome-engineering.org)中，設(shè)計(jì)了三組特異性sgRNA，如表1所示，送生工公司合成.

表1 靶向SBNO2基因的sgRNA序列Table 1 The sequence of sgRNA targeting SBNO2 gene

pSpCas9-puro-2A載體(Addgene公司)經(jīng)BbsI酶切，放置55 ℃酶切1 h，酶切后回收線性載體.單鏈sgRNA序列退火后形成雙鏈DNA，反應(yīng)體系為：正向和反向sgRNA(已稀釋至100 μmol/L)各1 μL，10×T4 Ligation Buffer 1 μL，T4 PNK 1 μL，ddH2O 6 μL,共10 μL.反應(yīng)條件為37 ℃，30 min；95 ℃，5 min；之后以每分鐘降5 ℃從95 ℃降到25 ℃.利用T4連接酶將雙鏈DNA插入線性化的pSpCas9-puro-2A載體U6啟動子的下游，16 ℃反應(yīng)3 h.之后加入ATP(10 mmol/L) 1.5 μL，ATP-dependent Plasmid Safe Exonuclease 1 μL，10 × Plasmid-Safe Buffer 1.5 μL；反應(yīng)時(shí)間為37 ℃，30 min；70 ℃，30 min.最后將連接好的全部產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，培養(yǎng)后挑取單克隆菌落送生工測序.

1.2.3SBNO2基因敲除的細(xì)胞系制備及篩選 將BHK-21細(xì)胞鋪到6孔板中，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%時(shí)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，按照3 μg/mL加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，經(jīng)過幾輪篩選后，陰性細(xì)胞全部死亡，將狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行傳代，采用有限稀釋法對細(xì)胞按比例稀釋到100 mm培養(yǎng)皿中，將試驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行單個(gè)消化，挑取單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，傳代后凍存?zhèn)溆?

1.2.4 BHK-21-SBNO2細(xì)胞系中SBNO2基因敲除及蛋白表達(dá)檢測

1.2.4.1 測序驗(yàn)證BHK-21-SBNO2細(xì)胞系 收取單克隆細(xì)胞株，按照基因組提取試劑盒中的操作步驟提取基因組，PCR擴(kuò)增后送生工公司進(jìn)行測序及序列比對，確定SBNO2基因敲除的位置.

1.2.4.2 Western Blot檢測細(xì)胞系中SBNO2的蛋白表達(dá)水平 收取BHK-21-Ctrl和BHK-21-SBNO2單克隆細(xì)胞系，采用Western Blot的方法對細(xì)胞中SBNO2的蛋白水平進(jìn)行檢測，方法參考1.2.2.

1.2.5 敲除SBNO2基因?qū)MDV復(fù)制的影響 用0.1 MOI FMDV分別感染BHK-21-Ctrl和BHK-21-SBNO2單克隆細(xì)胞，感染后6 h收取細(xì)胞提取總RNA.采用qRT-PCR的方法檢測細(xì)胞中結(jié)構(gòu)蛋白VP1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平.首先將收取的細(xì)胞用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，然后用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.以β-Actin作為內(nèi)參基因(β-Actin-F:GCTGGCCGGGACCTGACAGACTACC；β-Actin-R:TCTCCAGGGAGGAAGAGGATGCGGC)，qRT-PCR檢測VP1的相對表達(dá)水平(VP1-F：GACAACACCACCAACCCA；VP1-R：CCTTCTGAGCCAGCACTT).反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，ddH2O 6 μL共20 μL.反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑侯A(yù)變性95 ℃，30 s；第二步：變性95 ℃，5 s；退火/延伸60 ℃，30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán).按照2-ΔΔct法對定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BHK-21細(xì)胞感染FMDV后SBNO2蛋白表達(dá)受到抑制

通過Western Blot方法檢測FMDV感染的BHK-21細(xì)胞中SBNO2蛋白表達(dá)水平，用ImageJ軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析.如圖1-A和1-B所示，與不接毒的對照組相比，F(xiàn)MDV感染4 h和6 h后BHK-21細(xì)胞中SBNO2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，F(xiàn)MDV感染4 h時(shí)，與對照組相比，SBNO2表達(dá)水平下調(diào)了約1.3倍(P<0.05)；FMDV感染6 h時(shí)，與對照組相比，SBNO2表達(dá)量下調(diào)了約3.5倍(P<0.05).如圖1-C和1-D所示，隨著FMDV感染復(fù)數(shù)的增加，細(xì)胞中SBNO2的表達(dá)量顯著減少.與對照組相比，感染0.1 MOI FMDV時(shí)SBNO2表達(dá)水平下調(diào)了約3倍(P<0.05).

A圖為FMDV感染不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)BHK-21細(xì)胞中SBNO2蛋白水平變化情況，其中“4 h”指FMDV持續(xù)感染4 h；“6 h”指FMDV持續(xù)感染6 h；“-”為不感染FMDV的對照組細(xì)胞；“+”代表感染FMDV組細(xì)胞.B圖為A圖的灰度掃描結(jié)果分析；C圖為不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的FMDV感染在BHK-21細(xì)胞后，SBNO2的蛋白水平變化情況； D圖為C圖的灰度掃描結(jié)果分析.Figure A shows the changes of SBNO2 protein levels in BHK-21 cells at different time points of FMDV infection,in which "4 h" refers to 4 h of continuous FMDV infection;"6 h" refers to 6 h of continuous FMDV infection;"-" is the control cell that is not infected with FMDV;"+" represents infected cells in the FMDV group.Figure B analysis of gray scanning results of Figure A;Figure C shows the changes of SBNO2 protein levels after FMDV infection with different infection complex (MOI) in BHK-21 cells.Figure D shows the gray scanning results of Figure C.圖1 FMDV感染后BHK-21細(xì)胞中SBNO2蛋白表達(dá)水平和灰度值分析Figure 1 Analysis of SBNO2 protein expression level in BHK-21 cells after FMDV infection

2.2 BHK-21-SBNO2細(xì)胞系中SBNO2基因及其蛋白敲除結(jié)果

2.2.1 Western Blot驗(yàn)證敲除細(xì)胞系中SBNO2的蛋白表達(dá)下調(diào) 收取7組不同的單克隆細(xì)胞系，通過Western Blot的方法對細(xì)胞中SBNO2的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測.如圖2所示，與對照組相比，有兩組克隆細(xì)胞株中SBNO2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，其中SBNO2-B5中SBNO2蛋白表達(dá)量下調(diào)約4倍(P<0.05)；SBNO2-D2中SBNO2蛋白表達(dá)量下調(diào)約3.3倍(P<0.05).表明SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組細(xì)胞系中SBNO2基因敲除效果明顯.

A圖和C圖分別為BHK-21細(xì)胞在敲除SBNO2后，SBNO2的蛋白表達(dá)水平變化；B圖為A圖的灰度掃描結(jié)果分析；D圖為C圖的灰度掃描結(jié)果分析.Figure A and Figure C show the changes of SBNO2 protein expression level in BHK-21 cells after SBNO2 knockout.Figure B shows the gray scanning results of Figure A;Figure D shows the gray scanning results of Figure C.圖2 敲除SBNO2蛋白的Western Blot鑒定結(jié)果和灰度值分析Figute 2 Identification of SBNO2 knockout efficiency by Western Blot

2.2.2 SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組細(xì)胞系測序結(jié)果 如圖3所示，與對照組相比，SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組細(xì)胞中SBNO2基因發(fā)生移碼突變，表明成功構(gòu)建敲除SBNO2基因細(xì)胞系.

圖3 SBNO2-B5和SBNO2-D2兩株敲除細(xì)胞系中SBNO2基因測序鑒定Figure 3 Sequence identification of SBNO2 gene in SBNO2-B5 and SBNO2-D2 cell lines

2.3 敲除SBNO2基因?qū)MDV復(fù)制影響的檢測結(jié)果

選用SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組SBNO2基因敲低的細(xì)胞系感染FMDV，通過qRT-PCR方法檢測FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的mRNA表達(dá)水平變化.如圖4所示，與對照組相比，SBNO2-B5和SBNO2-D2兩組細(xì)胞在感染FMDV 6 h后，VP1的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，其中SBNO2-B5組上調(diào)了約3.2倍(P<0.05)，SBNO2-D2組上調(diào)了約3.4倍(P<0.05).以上結(jié)果表明，與對照相比，SBNO2基因敲除的細(xì)胞系中，病毒復(fù)制加快.

圖4 敲除SBNO2基因?qū)MDV復(fù)制影響的檢測結(jié)果Figure 4 The impact of SBNO2 gene knockout on the replication of FMDV

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)能夠快速且高效地編輯各種生物體的基因組，已被廣泛用于特定基因組位點(diǎn)的功能域，以探索其發(fā)育機(jī)制和基因表達(dá)調(diào)控[12-13].本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)針對SBNO2基因設(shè)計(jì)了3組不同sgRNA的序列，構(gòu)建SBNO2基因敲除質(zhì)粒，并且成功獲得BHK-21-SBNO2敲除細(xì)胞系.敲除的細(xì)胞系中SBNO2基因表達(dá)被顯著抑制，在FMDV感染后，與對照細(xì)胞系相比，F(xiàn)MDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明BHK-21細(xì)胞中SBNO2基因敲除能夠促進(jìn)FMDV復(fù)制，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

SBNO2是抑制炎癥基因表達(dá)的IL-10調(diào)節(jié)通路的組成部分，主要受IL-10信號通路的調(diào)控，并參與NF-κB的抑制.通過對IL-10誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中特異性基因表達(dá)的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)SBNO2在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具有關(guān)鍵作用.研究發(fā)現(xiàn)，GP130細(xì)胞因子家族成員和促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNFα也能顯著上調(diào)SBNO2mRNA的表達(dá)，證明SBNO2在星形膠質(zhì)細(xì)胞以及CNS中的其他細(xì)胞中起急性炎癥反應(yīng)基因的作用[1].在小鼠和人的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，IL-6以劑量和時(shí)間依賴性的方式顯著上調(diào)SBNO2基因表達(dá)[1].隨著病毒感染時(shí)間和病毒總量的增加，一些抗病毒基因會出現(xiàn)表達(dá)量降低的現(xiàn)象[15].本研究中FMDV感染BHK-21細(xì)胞后SBNO2表達(dá)水平隨著時(shí)間、劑量的增加顯著降低，說明FMDV能夠影響SBNO2基因的表達(dá)，提示SBNO2基因可能在FMDV復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用.Kasmi等[3]發(fā)現(xiàn)在293T細(xì)胞中，SBNO2能夠顯著地影響NF-κB的轉(zhuǎn)錄.NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在病毒感染后的天然免疫應(yīng)答中起重要作用[16].NF-κB和IRF3作為IFN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以通過兩種不同的途徑影響IFN的表達(dá)[17]，從而影響宿主的天然免疫反應(yīng)及抗病毒基因的表達(dá).SBNO2可能作為天然免疫中的模式識別受體，介導(dǎo)NF-κB信號通路從而激活天然免疫應(yīng)答機(jī)制，對病毒感染后的免疫調(diào)控具有重要意義.面對敲除細(xì)胞系在FMDV感染后，病毒復(fù)制明顯增多.我們推測在本研究中SBNO2對FMDV增殖的影響也可能是通過調(diào)控宿主中IFN的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，但仍需要進(jìn)行后續(xù)研究對這一假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證.天然免疫是宿主抗病毒感染的第一道防線[18]，而在天然免疫過程中干擾素(IFN)的產(chǎn)生對于機(jī)體抗病毒感染具有重要作用.由于口蹄疫滅活疫苗需要大約7 d的時(shí)間誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)，那么在此期間通過抗病毒干預(yù)的方法，增強(qiáng)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答，能夠?yàn)闄C(jī)體提供早期保護(hù)、減少病毒復(fù)制從而控制口蹄疫的傳播[19-20].我們推測SBNO2能夠作為一種抗炎、抗病毒因子對天然免疫應(yīng)答起到正反饋?zhàn)饔茫転橐呙缃臃N或其他基于免疫的干預(yù)措施提供新的策略.

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功構(gòu)建了CRISPR/Cas9-SBNO2重組質(zhì)粒，采用嘌呤霉素篩選分離出BHK-21-SBNO2穩(wěn)定敲除細(xì)胞株，經(jīng)過測序及Western Blot驗(yàn)證，獲得了敲除SBNO2基因的BHK-21細(xì)胞系.FMDV感染BHK-21-SBNO2細(xì)胞系后，F(xiàn)MDV復(fù)制顯著增多，表明敲除SBNO2可促進(jìn)FMDV復(fù)制，為后續(xù)研究SBON2對口蹄疫病毒復(fù)制的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ).