復方中草藥對肉雞生長性能及天然免疫相關基因mRNA表達的影響

高強，賈綏安，杜寶龍，薛瑞林，唐德富，李守湖，柳紀省

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅 蘭州 730070)

近年來，肉雞養(yǎng)殖中抗生素的濫用導致致病菌的耐藥性越來越強，獸藥殘留造成雞肉食品安全問題受到消費者的密切關注，隨著2020年無抗禁令的實施，我國肉雞養(yǎng)殖進入無抗養(yǎng)殖時代，替抗產(chǎn)品的研究成為新的熱點，中草藥制劑、酶制劑、微生態(tài)制劑、植物精油等均被認為是潛在的替抗產(chǎn)品[1].中草藥作為一種綠色添加劑廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，其生物活性物質(zhì)能夠促進動物健康生長，使畜禽機體內(nèi)環(huán)境保持平衡狀態(tài)[2].而且中草藥具有毒副作用小、促進生長、促進動物新陳代謝、無耐藥性、提高飼料報酬、預防疾病等優(yōu)點[3]，它克服了化學合成藥物毒副作用大的缺點，是新一代安全性能較好的飼料添加劑[4-5].

中草藥應用于家禽已被國內(nèi)外學者進行了大量研究，多數(shù)研究結果表明，在飼糧中添加不同配方的復方中草藥，可以提高肉雞的生長性能、免疫功能以及肉品質(zhì)[6-7]，同樣促進育肥豬的增重速度并改善肉品質(zhì)[8].但是中草藥具有配伍不相容、用量大、作為添加劑使用缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量檢驗標準等缺點，復方中草藥調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用機制認識尚不清楚，還需進一步研究和探討[9].本試驗旨在評估復方中草藥對肉雞生長性能、免疫器官發(fā)育指數(shù)及天然免疫相關基因mRNA表達的影響，為復方中草藥在家禽生產(chǎn)中的應用以及替代抗生素的可行性提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用復方中草藥由蘭州威特森生物科技有限公司提供，主要成分為女貞子、板藍根、當歸、柴胡、丹參、黃芪.肉雞為科寶505白羽肉雞，購自陜西寶雞大成禽業(yè)有限公司.RNA提取試劑盒購自美國紐英倫生物技術公司(NEB)，SYBR qPCR SuperMix購自近岸科技有限公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自瑞士羅氏制藥有限公司，其他化學試劑均購自美國SIGMA生物科技有限公司.

1.2 試驗設計

本試驗采用單因素完全隨機設計，選擇1日齡健康‘白羽肉雞’504只，按照組平均體質(zhì)量相近原則分為7組，每組6個重復，每個重復12只雞，公母各半，分別飼喂基礎飼糧(對照組，A組)、基礎飼糧+抗生素(0.48 g/kg氟苯尼考，1～42 d，B組)、基礎飼糧+100 mL/kg復方中藥制劑提取物(C組，14～42 d)、基礎飼糧+100 mL/kg復方中藥制劑提取物(D組，21～42 d)、基礎飼糧+10 g/kg復方中藥粉末制劑(E組，14～42 d)、基礎飼糧+10 g/kg復方中藥粉末制劑(F組，21～42 d)、基礎飼糧+20 g/kg復方中藥粉末制劑(G組，14～42 d).飼養(yǎng)期為42 d，分前期(0～21 d)和后期(22～42 d)2期進行.

1.3 試驗飼糧

基礎飼糧組成見表1，營養(yǎng)參數(shù)參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T33-2004配制.配方計算時，原料中干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、有機物、鈣和總磷的含量均采用實測值，其他指標參考中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2017年第28版).試驗提供粉料飼喂肉雞.

表1 基礎飼糧配方組成及營養(yǎng)水平(風干基礎，%)Table 1 Composition and nutrient level of basal diets(air dried basis，%)

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗肉雞飼養(yǎng)管理參照《科寶肉雞飼養(yǎng)管理手冊》.采用3層立體疊籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，日飼喂3次.試驗期內(nèi)保持雞舍內(nèi)正常通風，按常規(guī)免疫程序進行免疫，每日巡欄觀察雞群精神狀態(tài)和采食情況，早晚各消毒1次，保持雞舍內(nèi)外空氣清潔衛(wèi)生.

1.5 樣品采集

1.5.1 血液樣品采集 分別于21、28、35、42 d以重復為單位，在A組和D組中每籠抽取與平均體質(zhì)量接近的2只雞(公母各1只)采集翅下靜脈全血，混合后-20℃保存，飼養(yǎng)試驗結束后帶回實驗室用于細胞因子的檢測.

1.5.2 免疫器官的采集 42日齡，以重復為單位每籠抽取與平均體質(zhì)量接近的2只雞(公母各1只)，稱其活質(zhì)量，屠宰解剖后立即分離胸腺、脾臟、法氏囊，用濾紙吸去血漬，剔除脂肪組織后稱鮮質(zhì)量，并計算免疫器官指數(shù).

1.6 測定指標與方法

1.6.1 生長性能及免疫器官指數(shù) 在肉雞飼養(yǎng)第0、21、42天時，分別以重復為單位對雞稱質(zhì)量及統(tǒng)計余料量，計算平均日采食量(AFI)、平均日增質(zhì)量(ADG)、料質(zhì)量比(F/G)以及免疫器官指數(shù).

1.6.2 細胞因子測定 以β-actin基因作為內(nèi)參基因，實時熒光定量測定肉雞血液中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TLR-3、TLR-4基因的mRNA相對表達量.

1.6.2.1 全血RNA的提取及cDNA的合成 將帶回實驗室的血樣解凍后立即提取全血RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟依照Quick-RNATM Whole Blood Catalog NoS.R1201試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行.

1.6.2.2 引物的合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TLR-3、TLR-4和β-actin的基因序列，利用primer 5軟件設計引物，詳細序列信息見表2，所有引物序列均由武漢金開瑞生物工程有限公司進行合成.

表2 免疫因子及內(nèi)參引物序列Table 2 Immune factors and internal reference primer sequences

1.6.2.3 熒光定量PCR 根據(jù)TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行反應，每個樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別進行擴增，每樣3個重復.反應體系共20 μL：cDNA樣2 μL；Universdl SYBR Green 10 μL；上、下游引物各1.5 μL；Free Water 5 μL.擴增條件的程序設置：98℃ 2 min；95℃ 10 s，60℃ 45 s 循環(huán)40次；90℃ 90 s；60℃ 3 min；94℃ 10 s.PCR反應結束后，使用PCR儀自帶的ABI7300 SDS Software分析軟件分析所得結果Ct值.目的基因的mRNA相對表達量用2-△△Ct計算，最終結果以GraphPad Prism 5軟件作圖表示.

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均用Excel 2013軟件進行整理，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著時用Duncan氏進行多重比較，P<0.05為差異顯著性判斷標準.

2 結果與分析

2.1 復方中草藥對肉雞生長性能的影響

由表3可見，試驗前期(0～21 d)，B組肉雞平均日采食量顯著高于A組和F組(P<0.05)，且其平均日增質(zhì)量顯著高于除C組和E組外的其他各組(P<0.05).試驗后期(22～42 d)，C組肉雞平均日采食量和平均日增質(zhì)量均顯著高于A組和E組(P<0.05)，B組肉雞平均日增質(zhì)量顯著高于A組、E組和F組(P<0.05).從全期(0～42 d)看，各處理組肉雞平均日采食量無顯著性差異(P>0.05)，但B組肉雞平均日增質(zhì)量顯著高于A組、D組和F組(P<0.05)，且C組、E組、G組肉雞平均日增質(zhì)量顯著高于A組(P<0.05)，而A組肉雞料質(zhì)量比顯著高于B組、C組和E組(P<0.05)，B組肉雞料質(zhì)量比顯著低于D組和F組(P<0.05).

表3 復方中草藥對不同生長階段肉雞生長性能的影響Table 3 Effects of compound chinese herbal medicine on growth performance of broilers at different growth stages

2.2 復方中草藥對肉雞免疫器官的影響

如表4所示，對于胸腺指數(shù)而言，B組顯著高于除C組和E組外的其他各組(P<0.05)，而C組和E組顯著高于A組(P<0.05).B組脾臟指數(shù)也顯著高于除C組和E組的其他各組(P<0.05)，而C組、E組和G組均顯著高于A組(P<0.05).各組間法氏囊指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05).

表4 復方中草藥對肉雞免疫器官的影響Table 4 Effects of compound Chinese herbal medicine on immune organs of broilers

2.3 復方中草藥制劑對肉雞血液細胞因子mRNA的影響

結果如圖1所示，與對照組相比，試驗組肉雞血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3、TLR4基因的mRNA在試驗期內(nèi)均有上升趨勢，而IL-10呈下降趨勢.試驗組IL-2、IL-8、TLR3、TLR4基因的mRNA在試驗期內(nèi)均顯著高于對照組(P<0.05)，整體呈上升趨勢；IL-6mRNA在28 d和35 d時顯著高于對照組(P<0.05)，呈上升趨勢；而試驗組IL-10mRNA在28 d和42 d時均顯著低于對照組(P<0.05)，呈下降趨勢.總體來看，在飼糧中持續(xù)添加復方中草藥可顯著提高肉雞血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3、TLR4mRNA表達量(P<0.05)，并顯著降低血液IL-10mRNA的表達豐度(P<0.05).

圖1 復方中草藥對肉雞血液細胞因子mRNA相對表達量的影響Figure 1 Effect of compound Chinese herbal preparations on relative expression of cytokine mRNA of blood by broilers

3 討論

飼糧中添加復方中草藥能有效提升肉雞生產(chǎn)性能已被國內(nèi)外多數(shù)試驗所證實，多數(shù)養(yǎng)殖場接受并通過中草藥添加劑來提升肉雞生產(chǎn)性能[10].本試驗前期結果顯示，B組平均日增質(zhì)量與平均日采食量均顯著高于其他各組，再次證實了抗生素提高肉雞生長性能的效果.后期B組平均日增質(zhì)量和平均日采食量與C組、D組和G組均無顯著性差異，表明飼糧添加復方中草藥與添加抗生素對肉仔雞的生長促進效果一致.全期結果顯示各組平均日采食量均無顯著差異，平均日增質(zhì)量結果B組、C組、E組優(yōu)于其余各組，但料質(zhì)量比C組最低，其結果表明C組添加效果優(yōu)于B組.唐日益等[11]研究復方中草藥添加劑(HMA)對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響，分別以連續(xù)和隔周在基礎飼糧中添加2 kg/t HMA為試驗組，結果顯示復方中草藥添加劑對生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)均有改善作用，且連續(xù)飼喂復方中草藥添加劑效果較好，本試驗結果與其相似.劉硯涵等[12]研究中草藥飼料添加劑對‘北京鴨’生產(chǎn)性能、免疫指標及肉品質(zhì)的影響，在基礎飼糧中分別添加0.1%(低劑量組)、0.2%(中劑量組)及0.5%(高劑量組)的復方中草藥，發(fā)現(xiàn)復方中草藥顯著提高北京鴨生長性能、屠宰性能，尤以0.2%的中草藥添加量效果最好.本試驗E組與G組各項生長性能檢測指標均無顯著差異，說明低劑量添加就可達到高劑量的添加效果.對于復方中草藥的配伍及添加量還需更多有力數(shù)據(jù)支撐，復方中草藥添加效果是否優(yōu)于抗生素還需后續(xù)試驗進行考證.

禽類的免疫器官主要有法氏囊、胸腺和脾臟，其中法氏囊和胸腺是禽類的中樞免疫器官，脾臟是禽類的次級免疫器官[13].免疫器官的發(fā)育狀態(tài)和功能直接決定著家禽的免疫水平，其良好的發(fā)育能有效降低肉雞的發(fā)病率，減少藥物的使用，保證肉制品的質(zhì)量和安全.女貞子所含的路類及苯芒醇巧類物質(zhì)具有補肝補腎、清虛熱的作用；板藍根當中所含有的黃酬類和三瞄皂巧類生物活性物質(zhì)具有清熱解毒的作用；當歸中含有的當歸多糖和揮發(fā)油具有補血活血、潤燥滑腸作用；柴胡中所含的皂苷能抑制各種炎癥因子引起的踝關節(jié)腫脹和結締組織增生性炎癥[14].將其加入肉雞基礎飼糧，可有效改善肉雞免疫器官的發(fā)育.蔡晴霞等[15]比較4種復方中藥添加劑對肉雞生產(chǎn)性能與免疫性能的影響，4個試驗組以拌料法和飲水法給藥，測定不同日齡肉雞免疫器官指數(shù)，結果顯示復方中藥2組可提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，其結果與本試驗結果基本一致.楊潤霞等[16]研究3種中藥復方制劑對雛雞免疫器官發(fā)育及免疫功能的影響，以黃芪、白術、防風等單味中藥組成3組中藥復方中草藥制劑，分別于42、52、62日齡對試驗雞進行檢測，結果顯示，試驗組雛雞胸腺、法氏囊發(fā)育良好，無明顯衰老癥狀.其結果與本試驗存在差異，可能與中草藥配方、基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平、飼養(yǎng)環(huán)境不同等因素密切相關[17].總體而言，復方中草藥對肉雞免疫器官的發(fā)育有促進作用.

IL-2又稱T細胞生長因子，可以激活T細胞，促進B細胞增殖和抗體分泌以及巨噬細胞的活化[18].IL-6主要能刺激活化的B細胞增殖和分泌抗體，刺激肝細胞合成急性期蛋白并參與炎癥反應，促進血細胞的發(fā)育[19].IL-8的主要生物學活性是吸引和激活中性粒細胞.中性粒細胞與IL-8接觸后發(fā)生形態(tài)變化，遷移到反應部位，釋放出一系列活性產(chǎn)物.這些作用可導致機體局部炎癥，達到殺菌和細胞損傷的目的[20].IL-10可通過活化的T細胞抑制細胞因子的產(chǎn)生，因此被稱為細胞因子合成抑制劑(cytokine synthesis inhibitor，csif)，特別是通過TH1細胞抑制IL-2、IFN-、LT等細胞因子的產(chǎn)生，從而抑制細胞免疫應答[21].TLR3信號通路可促進炎性因子的產(chǎn)生，在宿主抵抗活性病毒中發(fā)揮重要作用[22].TLR4受體在多種細胞中均有表達，例如單核巨噬細胞、中性粒細胞等[23].TLR可識別病毒囊膜蛋白，然后與病原分子結合，從而啟動機體免疫系統(tǒng)，最終引起趨化因子和炎癥因子的表達而發(fā)揮抗感染作用[24].寡糖、植物精油和微生態(tài)制劑可調(diào)節(jié)肉雞體內(nèi)部分基因IL及TLRsmRNA的表達已被多位學者早期證實，但目前關于復方中草藥對肉雞天然免疫相關基因表達的影響報道較少[25].馬景番等[26]探討不結球白菜提取物(NCCE)對肉雞脾臟細胞因子mRNA表達豐度的影響，分別在基礎飼糧中添加不同劑量的 NCCE，結果顯示，與對照組相比，NCCE能夠誘導肉雞脾臟IL-2、IL-4及IFN-γmRNA的表達，以添加500 mg/kg效果最好.熊阿玲等[27]探討不同水平的MOS對肉雞生長性能等的影響，天然免疫相關基因表達檢測結果顯示，飼糧添加MOS顯著影響肉雞組織TLR2和TLR4mRNA的表達.本試驗在基礎飼糧中持續(xù)添加復方中草藥，肉雞血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3和TLR4基因mRNA的表達量顯著高于對照組，并在試驗期內(nèi)呈顯著上升趨勢，且IL-10mRNA表達顯著下降，進一步說明了中草藥制劑也同樣具有增強免疫的功效.

4 結論

本試驗條件下，飼糧添加復方中草藥可提高肉雞生產(chǎn)性能、促進免疫器官的發(fā)育， 且在14～42日齡添加100 mL/kg復方中藥制劑提取物效果最佳；持續(xù)添加復方中藥制劑提取物可上調(diào)基因IL-2、IL-6、IL-8、TLR3、TLR4mRNA的表達，下調(diào)IL-10mRNA的表達.