復(fù)方中草藥制劑抑菌作用及其對(duì)湖羊部分細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

薛瑞林，高強(qiáng)，李守湖，柳紀(jì)省，馬友記,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 民勤 733300)

隨著我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)逐步向集約化、規(guī)?；较虬l(fā)展，養(yǎng)殖方式和養(yǎng)殖規(guī)模轉(zhuǎn)變，羊群運(yùn)動(dòng)量減少，加之飼養(yǎng)管理方面的不足，乳房炎已經(jīng)成為影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展的重要因素之一[1-2].目前，使用抗生素仍然是國(guó)內(nèi)外防治乳房炎的主流方法，但不管是傳統(tǒng)的對(duì)抗法還是以MIC為基礎(chǔ)獲得最佳療效的順勢(shì)法，本質(zhì)都是抗生素療法，難免產(chǎn)生耐藥性[3]，加之臨床上抗生素的不合理使用，甚至導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性，在造成企業(yè)養(yǎng)殖成本大大增加的同時(shí)，乳中大量藥物殘留也時(shí)刻威脅人類的健康[4].因此，及時(shí)準(zhǔn)確的掌握養(yǎng)殖場(chǎng)乳房炎病原菌的種類和耐藥性情況，并篩選有效治療乳房炎的藥物以代替抗生素進(jìn)行臨床上乳房炎的治療是控制乳房炎的關(guān)鍵.

中草藥作為一種傳統(tǒng)的“天然藥材”，因其副作用小、無(wú)毒無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性而成為近年來(lái)治療乳房炎的熱門選擇[5].研究發(fā)現(xiàn)，中藥可以促進(jìn)畜禽正常免疫器官發(fā)育，增強(qiáng)和恢復(fù)免疫功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫，促進(jìn)多種細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，對(duì)動(dòng)物機(jī)體有很好的免疫促進(jìn)作用[6].本研究就使用復(fù)方中草藥制劑，通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)和藥物注射實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)該制劑對(duì)乳房炎3種病原菌的抑菌效果及其對(duì)湖羊體內(nèi)IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等7種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響，以期為該制劑在臨床上的應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)臨床上減少抗生素的使用，促進(jìn)畜牧業(yè)綠色無(wú)抗生產(chǎn)提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

菌株為本實(shí)驗(yàn)室從患有臨床乳房炎湖羊乳樣中分離得到菌株；牛津杯(6×8×10 mm)，購(gòu)自北京博納瑞生科技有限公司；復(fù)方中草藥制劑由蘭州威特森生物科技有限公司自主研發(fā)和提供；RNAprep pure Blood Kit試劑盒，購(gòu)自北京天根生物生化科技公司；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，購(gòu)自Promega公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa公司；Applied Biosystems Quant Studio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；10只年齡、胎次、健康狀況相近的預(yù)產(chǎn)期湖羊由武威普康養(yǎng)殖有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 菌液和中草藥制劑的制備 取純化培養(yǎng)后的菌株劃線于普通肉湯培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱培養(yǎng)12～16 h后，挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，利用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)3種菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液的終濃度為106CFU/ mL，標(biāo)記后備用.

復(fù)方中草藥制劑主要成分為白頭翁、板藍(lán)根、柴胡、丹參、黃芪、當(dāng)歸.該藥品經(jīng)離心、過(guò)濾和濃縮的預(yù)處理，使得生藥含量為1.0 g/mL.離心后，取上清液用試管二倍稀釋法稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL等6個(gè)濃度梯度，121 ℃高壓滅菌，標(biāo)記后4 ℃保存以進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn).

1.2.2 體外抑菌試驗(yàn) 吸取0.1 mL制備好的菌懸液，滴入事先準(zhǔn)備好的經(jīng)過(guò)高壓滅菌的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板內(nèi)，使用涂布器涂勻.參照陳薇[7]的方法，放置牛津杯，再用滴管往牛津杯中按濃度由大到小依次加入0.2 mL制備好的不同濃度中草藥制，蓋上平皿蓋.然后將滴加藥液的平皿水平置于恒溫箱內(nèi)，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥；10 mm～15 mm為中度敏感；大于15 mm為高度敏感[8].

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 復(fù)方中草藥制劑對(duì)3種乳房炎病原菌最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定參考柯文杰等[9]的方法進(jìn)行：將已二倍稀釋的復(fù)方中草藥制劑按濃度梯度依次分裝至試管，每個(gè)試管2 mL.再往每個(gè)濃度梯度試管中分別加入100 μL菌液，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù).同時(shí)每個(gè)梯度組設(shè)1支不含復(fù)方中草藥制劑只含等量菌液的陽(yáng)性對(duì)照管以及1支不含菌液只含復(fù)方中草藥制劑的陰性對(duì)照管.37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h.肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的最低藥物濃度為該藥的MIC.

1.2.4 最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 復(fù)方中草藥制劑對(duì)3種乳房炎病原菌最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定參考聶鱺蓉等[10]的方法進(jìn)行：從每種細(xì)菌的MIC和高于MIC濃度的各試管中分別吸取100 μL培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，肉眼觀察無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低復(fù)方中草藥制劑濃度即為最小殺菌濃度.

1.2.5 藥物注射及血樣采集 將母羊隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只.母羊分娩當(dāng)天記為第0天，試驗(yàn)期28 d.試驗(yàn)組母羊分別在分娩后1、4、7 d按5 mL/只肌肉注射復(fù)方中草藥制劑，對(duì)照組母羊不作處理.隨機(jī)選取試驗(yàn)組和對(duì)照組母羊各3只分別在用藥前和用藥結(jié)束后第1、3、7、14、21 d使用抗凝的采樣管頸部靜脈采集3 mL全血血樣，標(biāo)記并冷凍保存.

1.2.6 血液中RNA的提取及cDNA的合成 按RNAprep pure Blood Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取血樣中RNA，每個(gè)樣品重復(fù)提取3次，定量后按照Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.cDNA置于-20 ℃保存待用.

1.2.7 細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)量 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量.按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng).以β-actin作為內(nèi)參，用Ct(△△Ct)法來(lái)處理RT-PCR結(jié)果，計(jì)算結(jié)果用2-△△Ct表示.各細(xì)胞因子及β-actin的mRNA引物序列由Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并檢測(cè)，引物信息見(jiàn)表1.

表1 細(xì)胞因子及內(nèi)參引物序列Table 1 Primer sequences of cytokines and internal reference genes

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥制劑藥敏試驗(yàn)

使用不同濃度中草藥制劑進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，每株菌同一藥物濃度做3次重復(fù)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值(表2).結(jié)果顯示，該中草藥制劑對(duì)于3種乳房炎病原菌均有較強(qiáng)的抑殺作用.當(dāng)藥物濃度為1 g/mL時(shí)，3種病原菌抑菌圈均在20 mm以上，并且藥物濃度相同的情況下，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑普遍大于其他2種細(xì)菌.

表2 復(fù)方中草藥制劑耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果及判定Table 2 Resistance test results and determination of compound Chinese herbal medicine preparations

2.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

復(fù)方中草藥制劑對(duì)腸球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑對(duì)3種乳房炎病原菌的MIC依次分別為125、125、62.5 mg/mL，MBC分別為250、125、125 mg/mL.

2.3 細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量

采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)得到湖羊外周血中細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖1所示.與對(duì)照組相比，湖羊外周血中IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ mRNA表達(dá)量在試驗(yàn)期內(nèi)均表現(xiàn)為上升趨勢(shì).上述細(xì)胞因子中，除IFN-γ在第1 天表達(dá)量增加不顯著(P>0.05)，IL-2和IL-12在第21 天表達(dá)量增加不顯著(P>0.05)外，其余細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量在試驗(yàn)期內(nèi)均顯著上升(P<0.05或P<0.01).而在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)量下降，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05或P<0.01).

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥制劑的抑菌作用

本試驗(yàn)所用的菌株均從患臨床型乳房炎湖羊乳中分離鑒定得到，其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均為常見(jiàn)的乳房炎高致病菌，而糞腸球菌也是常見(jiàn)的乳房炎病原菌[11-12]，用復(fù)方中草藥制劑對(duì)這3種病原菌做藥敏測(cè)定，其結(jié)果對(duì)臨床試驗(yàn)更具有參考意義.許多研究表明，中藥及其提取物可以直接殺滅病原菌或通過(guò)多種途徑提高機(jī)體免疫力達(dá)到防治疾病的效果[13-14].本研究采用相比于醇提法操作更為簡(jiǎn)單、成本更為低廉的水提法提取白頭翁、柴胡、黃芪、當(dāng)歸等6味中草藥的有效成分，進(jìn)行乳房炎病原菌的體外抑菌試驗(yàn).抑菌結(jié)果顯示，復(fù)方中草藥制劑對(duì)引起湖羊乳房炎的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌均有良好的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng).與金蘭梅[15]研究結(jié)果基本一致.從本試驗(yàn)研究可以認(rèn)為該制劑對(duì)湖羊乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌均有很好的抑殺作用，對(duì)臨床上使用中草藥制劑防治湖羊乳房炎、篩選對(duì)乳房炎病原菌有良好抑殺作用的中草藥物進(jìn)行防治湖羊乳房炎的獸藥研發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義.

同一日齡不同處理組相比，* 表示差異顯著(P<0.05)；** 表示差異極顯著(P<0.01).Among different groups in the same day age，* indicate significant difference(P<0.05)；** indicate extremely significant difference(P<0.01).圖1 湖羊外周血中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ在用藥前和用藥后的mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 1 The relative mRNA expression of IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，TNF-α and IFN-γ before and after medication in peripheral blood of Hu sheep

3.2 復(fù)方中草藥制劑對(duì)細(xì)胞因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有多種生物活性的小分子蛋白質(zhì)[16].可被分為白細(xì)胞介素、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趨化因子、生長(zhǎng)因子等，具有間接反應(yīng)動(dòng)物細(xì)胞免疫功能的作用[17].而中草藥成分豐富，富含糖類、皂苷類、生物堿、揮發(fā)性物質(zhì)和有機(jī)酸等多種免疫活性成分，不僅對(duì)疾病和病原微生物有抑制作用，還能調(diào)節(jié)畜禽體內(nèi)細(xì)胞因子的生成和釋放、增強(qiáng)免疫和繁殖能力，具有良好的替抗?jié)摿18-20].Chu等[21]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖、淫羊藿多糖、當(dāng)歸多糖、蜂膠黃酮和黃芪總苷均可在體內(nèi)和體外不同程度地提高T淋巴細(xì)胞中IL-2 mRNA的表達(dá)水平.在飼料中添加黃芪、當(dāng)歸、柴胡、魚(yú)腥草等組成的中草藥制劑可提高雛雞脾臟中IL-2、IL-4和IFN-γ的mRNA表達(dá)量[22].而本研究使用復(fù)方中草藥制劑處理湖羊母羊后，發(fā)現(xiàn)該制劑可以在轉(zhuǎn)錄水平上提高湖羊外周血中IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，降低IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，該結(jié)果可以為該制劑在臨床上的應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ).但是細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受到多種因素的綜合調(diào)控，并且細(xì)胞因子之間作用效果、作用途徑也不盡相同[23].因此，該制劑的免疫機(jī)理研究還應(yīng)聯(lián)合其他免疫效應(yīng)，綜合分析，本次試驗(yàn)結(jié)果為下一步工作提供了重要參考和啟示.

4 結(jié)論

復(fù)方中草藥制劑對(duì)引起湖羊乳房炎的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌等有很好的抑殺作用，并可以上調(diào)IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表達(dá)，下調(diào)IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá).