具有沙門氏菌拮抗能力的植物乳桿菌益生特性評價(jià)

張?zhí)鹛穑?瑤，呂文亮，林顯華，徐海燕，谷 巍

(山東寶來利來生物工程股份有限公司/山東省動物微生態(tài)制劑省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271017)

畜牧養(yǎng)殖行業(yè)主要依賴抗生素來防治動物疾病，而抗生素的大量使用卻引發(fā)了獸藥殘留、超級細(xì)菌的出現(xiàn)等問題[1]。隨著人們對動物食品品質(zhì)要求的提高、監(jiān)管部門對獸藥殘留的嚴(yán)格控制，市場對安全、高效、低毒獸藥的需求越來越高，微生態(tài)制劑的研究為開發(fā)綠色、安全、有效的抗生素替代產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。乳桿菌屬和雙歧桿菌屬及其他腸道微生物組中占優(yōu)勢的益生菌，已被證明可通過免疫刺激、營養(yǎng)競爭、抑制病原菌和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來改變腸道微生物群落并降低動物疾病風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。植物乳桿菌是益生菌中的主要候選菌株，因?yàn)樗鼈兙哂锌苟喾N病原體的抗菌活性、對膽汁和低酸堿度的耐受性以及對腸細(xì)胞的黏附性[4-6]。REN等[7]的研究結(jié)果表明，植物乳桿菌可促進(jìn)幼稚T細(xì)胞分化(Th1)并參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，具有預(yù)防和控制食源性疾病的潛力；SERVIN等[8]、HAMILTON-MILLER[9]的研究結(jié)果均表明，植物乳桿菌對沙門氏菌、志賀氏菌、假單胞菌和螺桿菌等具有良好的拮抗作用；TARRAH等[10]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌LSC3可有效地黏附在黏蛋白和腸細(xì)胞上。

針對雞白痢沙門氏菌病，目前的益生菌產(chǎn)品以復(fù)合微生態(tài)制劑為主。李瑞香等[11]使用乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等組成的復(fù)合微生態(tài)制劑預(yù)防雛雞雞白痢沙門氏菌病，雛雞成活率可提高30%，其中的乳酸桿菌需要與多種其他菌種復(fù)配才能達(dá)到一定的防治效果。蔡榮等[12]使用地衣芽孢桿菌、發(fā)酵乳桿菌、黏性優(yōu)桿菌、雙叉雙歧桿菌等組成的復(fù)合微生態(tài)制劑，可有效防治雞白痢沙門氏菌病。益生菌的生物學(xué)特性研究是微生態(tài)制劑研制的重要基礎(chǔ)性工作。為儲備抗沙門氏菌病的候選菌株，從自貯存的益生菌中篩選具有良好雞白痢沙門氏菌拮抗能力的乳酸菌，并評價(jià)其生長性能、酸堿耐受性、消化酶耐受性、腸道黏膜黏附能力、安全性、傳代穩(wěn)定性等益生性能，以期為益生菌株的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試培養(yǎng)基及緩沖液

MRS培養(yǎng)基[13]、LB培養(yǎng)基[14]、PBS緩沖液[15]、糞便培養(yǎng)基[16]均參照對應(yīng)文獻(xiàn)中方法配制。

1.2 供試菌株

乳酸菌BLCC2-0410、BLCC2-0154、BLCC2-0155、BLCC2-0107、BLCC2-0001、BLCC2-0112、BLCC2-0111、BLCC2-0092、BLCC2-0038，雞白痢沙門氏菌BLCC8-0017、BLCC8-0098，均由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物工程研究院菌種資源保藏中心提供。

雞白痢沙門氏菌CVCC537、CVCC533購買自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 供試糞便

樣品取自泰安鳳臺農(nóng)貿(mào)市場。

1.4 抑菌試驗(yàn)

采用牛津杯法[17]測定各益生菌株發(fā)酵液(均培養(yǎng)16 h)對雞白痢沙門氏菌的體外抑菌效果。

1.5 植物乳桿菌BLCC2-0410與雞白痢沙門氏菌的共培養(yǎng)試驗(yàn)

1.5.1 菌液的制備 將植物乳桿菌BLCC2-0410接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件培養(yǎng)18 h，4 000 r/min離心5 min，獲得的菌體用PBS重懸，并調(diào)整菌液OD600值為0.1，備用。

接種雞白痢沙門氏菌CVCC533于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩器120 r/min培養(yǎng)18 h，4 000 r/min離心5 min，獲得的菌體用PBS重懸，并調(diào)整菌液OD600值為0.1，備用。

1.5.2 共培養(yǎng) 將植物乳桿菌BLCC2-0410菌懸液與雞白痢沙門氏菌菌懸液等體積混合，按1%(V/V)接種至半固體糞便培養(yǎng)基中，作為共培養(yǎng)組(RS組)；植物乳桿菌BLCC2-0410菌懸液與PBS等體積混合，以1%(V/V)接種至半固體糞便培養(yǎng)基中，作為植物乳桿菌BLCC2-0410培養(yǎng)組(R組)；雞白痢沙門氏菌菌懸液與PBS等體積混合，以1%(V/V)接種至半固體糞便培養(yǎng)基中，作為雞白痢沙門氏菌培養(yǎng)組(S組)。各組置于37 ℃搖床中120 r/min培養(yǎng)，于24 h進(jìn)行雞白痢沙門氏菌和植物乳桿菌BLCC2-0410的計(jì)數(shù)。

1.6 植物乳桿菌BLCC2-0410菌株的生物學(xué)特性測定

1.6.1 生長曲線的測定 將活化的菌液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，于不同的培養(yǎng)時(shí)間取樣測定pH值以及活菌數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)活菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.6.2 耐酸性試驗(yàn) 將活化的菌液分別接種于pH值為2.5和3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，以pH值6.0的MRS培養(yǎng)基為對照，37 ℃培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

存活率=(待測pH值的菌液活菌數(shù)/初始菌液活菌數(shù))×100%。

1.6.3 膽鹽耐受性試驗(yàn) 將活化的菌液分別接種于含0.1%、0.2%、0.3%禽膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，以不加禽膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對照，37 ℃培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

存活率=(待測膽鹽含量的菌液活菌數(shù)/初始菌液活菌數(shù))×100%。

1.6.4 消化酶耐受性試驗(yàn) (1)人工消化液的制備：參照《中國藥典》中人工胃液及人工腸液方法制備[18]。(2)益生菌菌液制備：取植物乳桿菌BLCC2-0410過夜培養(yǎng)液，離心收集菌體，使用無菌生理鹽水復(fù)溶，稀釋10倍備用。(3)消化酶耐受性試驗(yàn)：將制備的菌液1 mL與9 mL胃蛋白酶液混合，37 ℃靜置培養(yǎng)，于0、2、4 h分別計(jì)數(shù)。將制備的菌液1 mL與9 mL胰蛋白酶液混合，37 ℃靜置培養(yǎng)，于0、4 h分別計(jì)數(shù)。

1.6.5 腸道黏附試驗(yàn) 取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加0.5 mL黏液，4 ℃過夜固定后，每孔加0.5 mL無菌生理鹽水洗滌2次，然后每孔加0.5 mL標(biāo)記菌懸液。另以未加黏液的0.5 mL標(biāo)記菌懸液作陽性對照，28 ℃孵育2 h。除陽性對照外，再用0.5 mL無菌生理鹽水洗去未黏附的細(xì)菌。

收集吸出的懸液和每次的洗滌液，采用梯度稀釋法進(jìn)行菌體計(jì)數(shù)，計(jì)算出未黏附的總菌量，最后計(jì)算出該菌黏附的百分比。黏附率=1-(未黏附菌量/陽性對照)×100%。

1.6.6 植物乳桿菌BLCC2-0410安全性試驗(yàn) 引入健康海蘭褐雛雞，自0日齡開始，采用經(jīng)口灌喂法給予受試菌液及生理鹽水，灌喂量為0.5 mL/只，每天2次(早、晚各1次)，灌喂至10日齡。每天稱量體質(zhì)量。其中對照組雛雞灌喂滅菌生理鹽水，試驗(yàn)組雛雞灌喂植物乳桿菌BLCC2-0410菌液，低劑量組和高劑量組分別灌喂活菌量為1.0×1010cfu/mL、1.0×1011cfu/mL的菌液。試驗(yàn)期間雛雞自由采食，飼喂環(huán)境相同。觀察雛雞精神狀態(tài)，記錄雛雞體質(zhì)量及進(jìn)食量、死亡情況，剖檢觀察肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等臟器病變情況。

1.6.7 植物乳桿菌BLCC2-0410傳代穩(wěn)定性測定 將植物乳桿菌BLCC2-0410接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h作為第1代菌液，以1%(V/V)比例接種于另一MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h作為第2代菌液，如此連續(xù)接種傳至第25代。對5代、15代、25代細(xì)菌培養(yǎng)物測試抑制CVCC533的性能，同時(shí)進(jìn)行菌液計(jì)數(shù)并測定其pH值，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩試驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出，植物乳桿菌BLCC2-0410對4株雞白痢沙門氏菌均有抑制效果，且抑制效果最好，對CVCC537、CVCC533、BLCC8-0098的抑菌圈直徑均在15 mm以上，對BLCC8-0017的抑菌圈直徑也在11 mm以上，其他菌株對雞白痢沙門氏菌抑菌圈較小，甚至無抑菌圈。由此可見，在9株乳酸菌中，植物乳桿菌BLCC2-0410對雞白痢沙門氏菌抑制效果最好。

表1 益生菌株對雞白痢沙門氏菌的抑菌圈直徑

2.2 植物乳桿菌BLCC2-0410與雞白痢沙門氏菌的共培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，植物乳桿菌BLCC2-0410與雞白痢沙門氏菌共培養(yǎng)24 h，雞白痢沙門氏菌數(shù)量降低了約3個(gè)對數(shù)值；共培養(yǎng)對植物乳桿菌BLCC2-0410的生長影響較小，與植物乳桿菌BLCC2-0410培養(yǎng)組相比，活菌數(shù)僅低0.4個(gè)對數(shù)值。

圖1 共培養(yǎng)條件下雞白痢沙門氏菌(A)和植物乳桿菌BLCC2-0410(B)的生長性能

2.3 植物乳桿菌BLCC2-0410的生物學(xué)特性

2.3.1 生長曲線的測定 如圖2所示，植物乳桿菌BLCC2-0410接種后2 h即進(jìn)入對數(shù)生長期，8 h即進(jìn)入穩(wěn)定期，11～12 h達(dá)到最高活菌數(shù)4.7×109cfu/mL，24 h后進(jìn)入衰亡期。菌液發(fā)酵至16 h達(dá)最低pH值，為3.74?？梢?，植物乳桿菌BLCC2-0410生長性能良好，產(chǎn)酸性能強(qiáng)。

2.3.2 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果 從表2可以看出，植物乳桿菌BLCC2-0410在pH值2.5和3.0的酸性環(huán)境培養(yǎng)4 h，存活率分別為33.1%、88.9%，說明該菌可耐受pH值2.5和3.0的酸性環(huán)境。

2.3.3 膽鹽耐受性試驗(yàn)結(jié)果 從表3可以看出，植物乳桿菌BLCC2-0410在0.1%禽膽鹽環(huán)境中培養(yǎng)4 h，存活率為97%。隨著禽膽鹽含量的增加，存活率下降，在0.2%、0.3%禽膽鹽環(huán)境中培養(yǎng)4 h，存活率分別為31%和4%，但活菌數(shù)仍在1.0×106cfu/mL以上。由此可以看出，植物乳桿菌BLCC2-0410對0.1%～0.3%的膽鹽環(huán)境具有一定的耐受能力。

圖2 植物乳桿菌BLCC2-0410的生長曲線及pH值變化曲線

表2 植物乳桿菌BLCC2-0410耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

表3 植物乳桿菌BLCC2-0410禽膽鹽耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 消化酶耐受性試驗(yàn)結(jié)果 從表4可以看出，在胃蛋白酶液中處理2 h，植物乳桿菌BLCC2-0410存活率為78.6%，處理4 h存活率為34.3%；在胰蛋白酶液中處理4 h，植物乳桿菌BLCC2-0410存活率為77.8%。由此可知，植物乳桿菌BLCC2-0410對胰蛋白酶及胃蛋白酶均有較強(qiáng)的耐受性。

2.3.5 腸道黏附試驗(yàn)結(jié)果 植物乳桿菌BLCC2-0410對腸黏膜具有一定的黏附能力。陽性對照組菌液活菌數(shù)為3.3×108cfu/mL，未黏附的菌量為2.7×108cfu/mL。由此可知，植物乳桿菌BLCC2-0410對腸黏膜的黏附率為18.2%。

表4 植物乳桿菌BLCC2-0410消化酶耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 植物乳桿菌BLCC2-0410安全性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)期間，高劑量組、低劑量組及對照組雛雞精神狀態(tài)良好，糞便形態(tài)無明顯差異，各組雛雞體質(zhì)量及進(jìn)食量無明顯差異(圖3、圖4)，剖檢觀察肝臟、脾臟、肺臟、腎臟均無肉眼可見病變。綜上說明，在試驗(yàn)活菌含量范圍內(nèi)，植物乳桿菌BLCC2-0410對雛雞是安全的。

圖3 植物乳桿菌BLCC2-0410對雛雞體質(zhì)量的影響

圖4 植物乳桿菌BLCC2-0410對雛雞進(jìn)食量的影響

2.3.7 植物乳桿菌BLCC2-0410傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 如圖5所示，植物乳桿菌BLCC2-0410連續(xù)傳5代、15代、25代細(xì)菌形態(tài)均為短桿菌，菌體大小均勻、形態(tài)單一。

圖5 植物乳桿菌BLCC2-0410各代次的菌體形態(tài)

從表5可以看出，各代次菌液活菌含量、發(fā)酵液pH值以及對雞白痢沙門氏菌的抑菌圈直徑均差別不大。說明植物乳桿菌BLCC2-0410傳代穩(wěn)定性良好。

表5 植物乳桿菌BLCC2-0410的傳代穩(wěn)定性測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

乳酸菌可以通過產(chǎn)生H2O2、抗菌素、有機(jī)酸等各種代謝產(chǎn)物來抑制致病菌的生長[19-23]。ZHANG等[1]的研究結(jié)果表明，乳酸菌可在體外有效抑制大腸桿菌和白痢沙門氏菌的生長。本研究結(jié)果顯示，BLCC2-0410對3株雞白痢沙門氏菌的抑菌圈直徑在15 mm以上，對另外1株沙門氏菌抑菌圈直徑介于11～15 mm，與其他乳酸菌株相比，體外抑菌效果最好，且與雞白痢沙門氏菌共培養(yǎng)可有效降低沙門氏菌的數(shù)量。大量研究表明，菌株生長得越快，越容易獲得競爭優(yōu)勢[24-27]。本研究結(jié)果顯示，植物乳桿菌BLCC2-0410在37 ℃培養(yǎng)2 h即進(jìn)入菌株生長對數(shù)期，最高活菌數(shù)可達(dá)4.7×109cfu/mL，生長速度快，生長性能良好。植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵液最低pH值為3.74，顯著低于靳勝男等[17]篩選出的乳酸菌發(fā)酵液pH值4.21，表明植物乳桿菌BLCC2-0410產(chǎn)酸性能相對良好。

益生菌能否通過胃腸道并發(fā)揮其益生作用，與其對胃腸環(huán)境的耐受性密切相關(guān)[28]。這些環(huán)境包括消化道中的酶、pH值和膽鹽等。現(xiàn)有資料顯示，禽類的胃內(nèi)pH值為2.5～5.1[25]。植物乳桿菌BLCC2-0410在胃蛋白酶液中處理2 h，存活率78.6%，在pH值2.5和3.0時(shí)的存活率為33.1%、88.9%。本研究結(jié)果與郝露露等[29]的研究結(jié)果相似，菌株32E、B14、C24在pH值3.0的人工模擬胃液中處理3 h內(nèi)存活率為80%以上。因此認(rèn)為，植物乳桿菌BLCC2-0410能耐受雞胃環(huán)境中的酸和消化酶的環(huán)境。消化道中的膽汁可以防止病原菌黏附到腸黏膜頂部并避免細(xì)胞損傷[30]，同時(shí)，也對乳酸菌的存活產(chǎn)生威脅。資料顯示，禽腸道中的膽鹽含量為0.03%～0.3%[31]。本研究中，菌株在胰蛋白酶液中處理4 h，植物乳桿菌BLCC2-0410存活率77.8%；隨著禽膽鹽含量的增大，存活率下降，在禽膽鹽含量0.3%時(shí)，存活率為4%，但活菌數(shù)仍可在106cfu/mL以上。BEGLEY等[32]和LAHTEINEN等[33]的研究結(jié)果表明，乳酸菌若在腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用，其攝入腸道內(nèi)的活菌含量需達(dá)到106～107cfu/mL。可見，植物乳桿菌BLCC2-0410能耐受雞腸道中的膽鹽及消化酶的環(huán)境。

乳酸菌對腸道的黏附有助于增強(qiáng)乳酸菌和腸細(xì)胞之間的信號交換，進(jìn)而促進(jìn)其在腸中的定植，并競爭性抑制病原體的定殖、提高機(jī)體免疫力[34]。因此，乳酸菌的黏附性是評估其用作益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)，已有資料證明乳酸桿菌具有與細(xì)菌病原體類似的表面黏附素[35]。一些表面定位的分子如脂磷壁酸、凝集素樣分子和蛋白質(zhì)，被鑒定為與宿主細(xì)胞表面上的特定受體相互作用的黏附素[8,36]。本研究中，植物乳桿菌BLCC2-0410對腸道具有一定的黏附能力，黏附率為18.2%。與郝露露等[29]的研究相比，黏附率略低，可能與菌株活菌含量、生長階段、表層蛋白等因素有關(guān)[37]。

安全與否是菌株能否應(yīng)用的基礎(chǔ)，菌株安全性一般是通過體內(nèi)或體外的方式考察，如魯旭等[38]通過有毒代謝產(chǎn)物的測定及小鼠口服灌喂方式研究了糞腸球菌的安全性；蔡熙姮等[39]通過腹腔注射小鼠的方式證明藍(lán)狐源嗜酸乳桿菌菌株是安全的。本研究使用本體動物雞，以最高1.0×1011cfu/mL的活菌含量，采取口服灌喂的方式進(jìn)行了動物安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明，高、低劑量灌喂均未引起雞只的死亡，各組雛雞體質(zhì)量及進(jìn)食量與對照組無差異，剖檢觀察雛雞肝臟、脾臟、肺臟、腎臟均無肉眼可見病變。綜上，植物乳桿菌BLCC2-0410對雛雞無明顯致病性，可作為禽用益生菌開發(fā)的儲備資源。

遺傳物質(zhì)在復(fù)制過程中出現(xiàn)差錯的頻率為百萬分之一，絕大多數(shù)的突變對菌株生命活動影響不大，但在發(fā)酵過程中，菌種的連續(xù)傳代可能會導(dǎo)致菌株負(fù)變個(gè)體的不斷積累，達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，造成菌種生產(chǎn)性狀、培養(yǎng)特性等的變化，退化現(xiàn)象會逐漸顯現(xiàn)[40]。本研究中，植物乳桿菌BLCC2-0410傳代5代、15代、25代的發(fā)酵性能、產(chǎn)酸能力、抑菌性能均無較大差異，說明植物乳桿菌BLCC2-0410傳代25代以內(nèi)穩(wěn)定性良好。為保證菌株質(zhì)量，可控制菌株傳代次數(shù)在15代以內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。

綜上，本研究篩選了1株對雞白痢沙門氏菌具有良好抑制作用的植物乳桿菌，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，有很大的開發(fā)潛力，有望在動物疾病防控中發(fā)揮重要作用。