應(yīng)用溴甲酚紫建立貴州省辣椒炭疽病菌快速選藥技術(shù)研究

劉阿麗，吳小毛,3，李榮玉,3，韓 磊，劉旭東，羅 躍

(1.貴州大學(xué) 作物保護(hù)研究所,貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴州 貴陽 550025； 3.貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025)

辣椒炭疽病是由半知菌亞門刺盤孢屬不同種引起的全球性真菌性病害[1-2]。辣椒炭疽病與辣椒疫病、辣椒病毒病被稱為辣椒上的三大病害。2016年，貴州辣椒炭疽病大面積暴發(fā)，嚴(yán)重影響了辣椒的品質(zhì)和產(chǎn)量[3]。隨著人民綠色環(huán)保意識的增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因作物和生物防治已成為當(dāng)今植物保護(hù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但化學(xué)藥物防治仍是防治植物病害的主要手段。近年來，化學(xué)農(nóng)藥也凸顯出諸多弊端，如農(nóng)藥殘留、有害生物再度猖獗、生物抗藥性、環(huán)境污染等問題。

咪鮮胺是一種廣譜殺菌劑，屬于麥角甾醇生物合成抑制劑，具有保護(hù)和鏟除作用，對多種作物子囊菌和半知菌病害有顯著防效[4]。而甲基硫菌靈是一種高效、廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，具保護(hù)和治療作用，主要通過干擾致病菌有絲分裂中紡錘體的形成，使病菌孢子萌發(fā)長出的芽管扭曲異常，從而使病菌不能正常生長而達(dá)到殺菌效果。韋繼彥等[5]研究表明，75%異菌·多·錳鋅可濕性粉劑、32.5%苯甲·嘧菌酯懸浮劑、25%吡唑醚菌酯懸浮劑、75%肟菌酯·戊唑醇水分散粒劑對于朝天椒葉片和果實(shí)上的炭疽病防效均較高；霍建飛等[6]明確咪鮮胺、咯菌腈、多菌靈和吡唑醚菌酯對尖孢炭疽菌菌絲抑制效果較好；莫佳強(qiáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)，25%咪鮮胺乳油500倍液對廣西忻城辣椒炭疽病的防治效果達(dá)87.38%?；瘜W(xué)農(nóng)藥的不合理使用容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，如咪鮮胺因長期大量使用已使部分地區(qū)稻瘟病菌產(chǎn)生抗藥性[4]。

溴甲酚紫的分子式為C21H16Br2O5S，中文別名為二溴鄰甲酚磺呋酞，可作為酸堿指示劑、吸附指示劑、氨基酸色譜法內(nèi)標(biāo)，還可用于銀鹽法滴定硫氰酸鹽、分光光度法沉淀血清蛋白等。寧偉杰等[8]認(rèn)為，溴甲酚紫肉眼識別的pH值變色范圍為5.2(黃色)～6.8 (紫色)，反應(yīng)化學(xué)式為： HIn? H++In-(可逆反應(yīng))；其中，HIn與In-在溶液中表現(xiàn)出2種顏色,HIn在溶液中呈現(xiàn)出黃色，In-在溶液中呈現(xiàn)出紫色。任會萍等[9]以溴甲酚紫為發(fā)色劑，以含羥基的芳香族化合物為顯色劑，制備了有機(jī)可逆熱變色材料。傅成武等[10]以溴甲酚紫為發(fā)色劑，制得鑭系復(fù)配物可逆熱致變色材料；其變色機(jī)制為溴甲酚紫的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)與醌式結(jié)構(gòu)之間的相互轉(zhuǎn)變,即分子間的電子得失。袁玉華等[11]在ELISA丙肝測定試劑盒樣品稀釋液中加入酸堿指示劑溴甲酚紫，作為樣品加注與否的指示，并進(jìn)行對比試驗(yàn)，取得了較好的效果。王菊叢等[12]發(fā)現(xiàn)，在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計數(shù)》(GB 4789.3—2010)執(zhí)行中，加入適量的溴甲酚紫指示劑,使結(jié)果觀察更直觀清楚。胡云峰等[13]運(yùn)用溴甲酚紫pH指示劑來檢測豬肉的新鮮程度，發(fā)現(xiàn)豬肉腐的程度與pH指示紙的顏色變化一致。何華鵬等[14]發(fā)現(xiàn)，溴甲酚紫指示劑制備的智能標(biāo)簽均能較好地識別不同質(zhì)量青魚的新鮮度。

目前，溴甲酚紫成功應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、食品安全方面，也逐漸應(yīng)用到病蟲害的檢測中，但采用溴甲酚紫檢測辣椒炭疽病菌對咪鮮胺和甲基硫菌靈的敏感性和抗藥性的研究尚未見報道，辣椒炭疽病菌對咪鮮胺和甲基硫菌靈的敏感基線也未見報道。因此，以敏感基線為基準(zhǔn)，應(yīng)用溴甲酚紫研制一種可以根據(jù)顏色變化來快速檢測防治藥劑對辣椒炭疽病菌是否有效的試劑盒，以解決田間施藥時選藥不準(zhǔn)的問題。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試分離物 炭疽病標(biāo)樣于2018年7—9月采自貴州省辣椒主產(chǎn)區(qū)，其中，花溪21株、遵義30株、黔東南29株、畢節(jié)20株，共計100株，并采用組織分離法獲得所需菌株，將分離、純化后的菌株進(jìn)行編號，鑒定后保存?zhèn)溆?。顯色反應(yīng)以尖孢炭疽菌為供試菌種。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂17～20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 供試藥劑 95%甲基硫菌靈(安徽廣信農(nóng)化股份有限公司)、97%咪鮮胺(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司)、溴甲酚紫(德州潤昕實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈和咪鮮胺的敏感性測定 采用菌絲生長速率法[15]測定辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈和咪鮮胺的敏感性。將甲基硫菌靈和咪鮮胺配制成5個質(zhì)量濃度梯度的含藥平板，分別為0.25、0.45、0.90、1.80、3.60 μg/mL和 0.023、0.045、0.090、0.180、0.360 μg/mL，以無菌水為對照。將菌餅接種于含藥PDA平板中央，每個處理重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5～7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，并運(yùn)用DPS 13.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算各藥劑對辣椒炭疽病菌菌絲生長抑制的回歸方程、抑制中質(zhì)量濃度(EC50值)、相關(guān)系數(shù)和95%置信區(qū)間，根據(jù)所得EC50值制作敏感性頻率分布圖，建立其敏感基線。

1.2.2 辣椒炭疽病菌快速選藥技術(shù)的建立 采用菌絲生長速率法[15]。以敏感基線為基準(zhǔn)，設(shè)置甲基硫菌靈和咪鮮胺質(zhì)量濃度分別為0.06、0.12、0.23、0.45、0.90、1.80 μg/mL和 0.011、0.022、0.044、0.088、0.175、0.350 μg/mL，加入30 μL 2%溴甲酚紫指示劑與藥劑均勻混合后，加入到含PDA滅菌培養(yǎng)基的錐形瓶中再次混勻，然后倒入直徑為9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，將菌餅接種于PDA平板中央。設(shè)含病原菌和指示劑的平板培養(yǎng)基為CK，只含指示劑的平板培養(yǎng)基作空白對照，每個處理3次重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)。其中，藥劑+顯色劑(溴甲酚紫)混合后為黃色，藥劑+指示劑+培養(yǎng)基混合后為淺綠色。分別在接種30 min、24 h、48 h、72 h后觀察辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈和咪鮮胺的顯色反應(yīng)與時間的變化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性分析

由表1可知，不同地區(qū)辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性存在一定差異。該藥劑對辣椒炭疽病菌菌株的EC50最小值為0.388 4 μg/mL，最大值為1.019 6 μg/mL，EC50均值為0.764 1 μg/mL。較敏感菌株的EC50值為不敏感菌株的EC50值2.63倍。遵義地區(qū)辣椒炭疽病菌菌株對甲基硫菌靈藥劑較為敏感，其EC50平均值為0.641 7 μg/mL；其次是花溪地區(qū)和黔東南地區(qū)，EC50均值分別為0.824 7 μg/mL和0.722 2 μg/mL；畢節(jié)地區(qū)的辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性較差，其EC50平均值為0.867 6 μg/mL。

表1 不同地區(qū)辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性

貴州省4個地區(qū)的100株辣椒炭疽病菌菌株對甲基硫菌靈的敏感性呈連續(xù)分布(圖1a)所示。以100個供試菌株的EC50值為依據(jù)，辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈的EC50值介于0.388 4～1.019 6 μg/mL；以0.09 μg/mL為截距，分成7個區(qū)間，計算每個區(qū)間的菌株頻率。以EC50中值為橫坐標(biāo)，頻率為縱坐標(biāo)， 繪制EC50的頻率分布圖(圖1b)。由圖1b可知，EC50值在0.57～0.93 μg/mL呈近似正態(tài)分布，有連續(xù)的單峰曲線，可將此曲線的EC50平均值(0.764 1±0.150 8) μg/mL作為辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感基線。

圖1 辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感性分布(a)及敏感性分布頻率(b)

2.2 辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈快速選藥技術(shù)分析

由圖2可知，甲基硫菌靈質(zhì)量濃度為0.23 μg/mL時，接菌30 min后顯淡紫色，但效果不明顯，其他質(zhì)量濃度無顏色變化；24 h后已經(jīng)出現(xiàn)顯色變化，48 h后顯色效果明顯，甲基硫菌靈質(zhì)量濃度為0.23 μg/mL顯紫色，0.45～0.90 μg/mL顯示橙色，質(zhì)量濃度為1.80 μg/mL時顯示淡黃色。72 h后可以作為顯色的判斷依據(jù)，加快了檢測速度。

a—d分別表示接種后30 min、24 h、48 h和72 h

當(dāng)用溴甲酚紫作為指示劑時，尖孢炭疽菌在PDA培養(yǎng)基的生長呈現(xiàn)出明顯的顏色變化如表2所示，甲基硫菌靈質(zhì)量濃度在0～0.23 μg/mL時顯示均為紫色，隨著甲基硫菌靈質(zhì)量濃度的上升，顏色逐漸變淡，藥劑質(zhì)量濃度在0.45～0.90 μg/mL時顯示出橙紅色，藥劑質(zhì)量濃度在1.80 μg/mL時呈現(xiàn)出淺黃色。

表2 不同質(zhì)量濃度甲基硫菌靈下溴甲酚紫顯色劑的顏色變化

2.3 辣椒炭疽病菌對咪鮮胺的敏感性分析

由表3可知，不同地區(qū)辣椒炭疽病菌對咪鮮胺的敏感性存在一定的差異，EC50最小值為0.041 8 μg/mL，最大值為0.102 4 μg/mL，EC50平均值為0.071 0 μg/mL。較敏感菌株的EC50值為不敏感菌株的EC50值2.45倍。畢節(jié)地區(qū)的辣椒炭疽病菌對咪鮮胺較敏感，其EC50平均值為0.066 0 μg/mL；其次是花溪地區(qū)和黔東南地區(qū)，EC50平均值均是0.068 4 μg/mL；而遵義地區(qū)的辣椒炭疽病菌對咪鮮胺敏感性最差，其EC50平均值為0.081 0 μg/mL。

貴州省4個地區(qū)的100株辣椒炭疽病菌菌株對咪鮮胺的敏感性呈連續(xù)分布(圖3a)。分析100個供試菌株的EC50值，辣椒炭疽病菌對咪鮮胺的EC50值介于0.041 8～0.102 4 μg/mL，以0.009 μg/mL為截距，將其分成7個區(qū)間，并計算出每個區(qū)間出現(xiàn)的菌株頻率。以區(qū)間EC50中值為橫坐標(biāo)，頻率為縱坐標(biāo)，以此數(shù)據(jù)繪制EC50的頻率分布圖(圖3b)。由圖3b可知，EC50值在0.059～0.95 μg/mL呈近似正態(tài)分布，故以EC50平均值(0.071 0±0.013 3) μg/mL作為辣椒炭疽病菌對咪鮮胺的敏感基線。

表3 不同地區(qū)辣椒炭疽病菌對咪鮮胺的敏感性

圖3 辣椒炭疽病菌對咪鮮胺的敏感性分布(a)及敏感性分布頻率(b)

2.4 辣椒炭疽病菌對咪鮮胺快速選藥技術(shù)分析

根據(jù)圖4發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺質(zhì)量濃度在0.022 μg/mL時接菌30 min后顯淡紫色，但顯色效果不明顯，其他質(zhì)量濃度無顏色變化，24 h后已出現(xiàn)顯色變化，48 h后顯色效果明顯，咪鮮胺質(zhì)量濃度為0.044 μg/mL顯紫色，0.088～0.175 μg/mL時顯示橙色，0.350 μg/mL時顯示淡黃色，72 h后可以作為顯色的判斷依據(jù)。

a—d分別表示接種后30 min、24 h、48 h和72 h

當(dāng)用溴甲酚紫作為指示劑時，尖孢炭疽菌在PDA培養(yǎng)基上生長時呈現(xiàn)出明顯的顏色變化如表4所示，在藥劑質(zhì)量濃度為0～0.044 μg/mL時顏色均為紫色，顏色隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加逐漸變淡，藥劑質(zhì)量濃度為0.088～0.175 μg/mL時顏色變成了橙紅色和橙黃色，質(zhì)量濃度為0.350 μg/mL時則變成了黃色。

表4 不同質(zhì)量濃度咪鮮胺下溴甲酚紫顯色劑的顏色變化

2.5 試劑盒的組成

研制出辣椒炭疽病菌2種快速選藥試劑盒，其中一是由2%溴甲酚紫溶液、0.45 μg/mL或0.90 μg/mL或1.80 μg/mL甲基硫菌靈及PDA培養(yǎng)基組成的試劑盒。病原菌在0.45 μg/mL甲基硫菌靈的試劑盒上顯示橙紅色，則表明比較敏感；在0.90 μg/mL甲基硫菌靈的試劑盒上顯示橙黃色，表明還可以作為辣椒炭疽病菌的防治藥劑；在1.80 μg/mL甲基硫菌靈的試劑盒上顯示黃色則表明已經(jīng)產(chǎn)生抗性。二是由2%溴甲酚紫溶液、0.088 μg/mL或0.175 μg/mL或0.350 μg/mL咪鮮胺及PDA培養(yǎng)基組成的試劑盒。在0.088 μg/mL咪鮮胺的試劑盒上顯示橙紅色則表明比較敏感；在0.175 μg/mL咪鮮胺的試劑盒上顯示橙黃色時，表明還可以作為辣椒炭疽病菌的防治藥劑；在0.350 μg/mL咪鮮胺的試劑盒上顯示黃色則表明已經(jīng)產(chǎn)生抗性。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對貴州省4個辣椒主產(chǎn)區(qū)100株辣椒炭疽病菌敏感性測定，建立了貴州省辣椒炭疽病菌對咪鮮胺的敏感基線為(0.071 0 ± 0.013 3)μg/mL，與楊石有等[16]研究結(jié)果中116株芒果炭疽病菌菌株對咪鮮胺的敏感性(其EC50均值為0.012 4 μg/mL)存在差異。本研究通過對貴州省4個地區(qū)100株辣椒炭疽病菌的敏感性進(jìn)行測定，建立了貴州省炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感基線為(0.764 1±0.150 8) μg/mL，這與董丁銘[17]建立的荔枝炭疽病菌對甲基硫菌靈的敏感基線[(0.643 3±0.215 6) μg/mL]存在一定的差異。貴州省辣椒炭疽病菌對咪鮮胺和甲基硫菌靈的敏感性與其他研究存在差異，可能是由于不同地區(qū)、不同作物、不同病原菌所致。本研究發(fā)現(xiàn)，貴州省4個地區(qū)辣椒炭疽病菌對咪鮮胺和甲基硫菌靈仍處于敏感水平，建議與其他類型殺菌劑交替使用以延長該類藥劑的使用壽命。

以敏感基線為基準(zhǔn)，應(yīng)用溴甲酚紫指示劑檢測辣椒炭疽病菌對甲基硫菌靈和咪鮮胺的敏感性顯色反應(yīng)，當(dāng)用溴甲酚紫作為指示劑時，pH值變色范圍為5.2(黃色)～6.8(紫色)，顏色變化比較明顯，檢測液的初始顏色呈紫色,反應(yīng)終點(diǎn)顏色變成黃色，區(qū)分度明顯[18]。酸堿指示劑溴甲酚紫的顯色度與酸量成正比，如郭真香等[19]研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌在生長過程中產(chǎn)生的酸使培養(yǎng)基的pH值下降，加入防治藥劑后，有抑制和殺菌的作用。本研究研制的試劑盒中，田間病原菌在0.350 μg/mL咪鮮胺試劑盒上顯示黃色則表明已經(jīng)產(chǎn)生抗性，在0.088 μg/mL咪鮮胺試劑盒上顯示橙紅色則表明比較敏感；在1.80 μg/mL甲基硫菌靈試劑盒上顯示黃色則表明已經(jīng)產(chǎn)生抗性，在0.45 μg/mL甲基硫菌靈試劑盒上顯示橙紅色則表明比較敏感。高曉月等[20]研究發(fā)現(xiàn)，溴甲酚紫指示劑添加量為20 mg/L、pH值為7.2時,檢測液顯色效果較好，此檢測方法可在3～4 h使指示劑變色(紫色～黃色)，易用肉眼區(qū)分，建立了對畜禽肉中抗生素進(jìn)行聯(lián)合初篩的高通量方法。在本試驗(yàn)中，試劑盒的檢測時間可以從7～10 d縮短為3 d，提高了甲基硫菌靈和咪鮮胺對辣椒炭疽病菌的檢測速度。目前，甲基硫菌靈和咪鮮胺對貴州省辣椒炭疽病菌依然有防治效果，但建議與其他藥劑進(jìn)行復(fù)配以提高藥效，延緩抗藥性的產(chǎn)生。本研究研制成的試劑盒可用于快速檢測辣椒炭疽菌對防治藥劑甲基硫菌靈和咪鮮胺的敏感度，可以指導(dǎo)農(nóng)民適時、適量科學(xué)用藥，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、社會與環(huán)境具有重要意義。