紅花1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因CtDXS1的克隆及表達(dá)分析

譚政委，李 磊，余永亮，許蘭杰，楊紅旗，董 薇，魯?shù)さ?，馬新明，梁慧珍

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息與管理科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

植物體能夠產(chǎn)生豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物[1-2]，這些代謝產(chǎn)物在植物生理生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，可以增強(qiáng)植物對(duì)蟲(chóng)害、病害、UV-B輻射等生物及非生物脅迫的抵抗力，還有一些次生代謝產(chǎn)物，可以作為植物傳粉者的引誘劑。植物次生代謝產(chǎn)物被開(kāi)發(fā)成中藥、農(nóng)藥、殺蟲(chóng)劑、染料等應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。大量研究表明，高等植物的代謝多樣性可能由植物為適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境需要所驅(qū)動(dòng)[3-4]。

萜類物質(zhì)是植物中最大的一類次生代謝產(chǎn)物，目前，在植物中鑒定的萜類化合物超過(guò)4萬(wàn)種[5-6]，包括單萜(如檸檬烯)、倍半萜(如橙花叔醇)、二萜(如紫衫醇)、三萜(如人參皂苷)、四萜(如類胡蘿卜素)和多萜(如質(zhì)體醌)[7]。萜類物質(zhì)的合成前體異戊二烯由3-異戊烯基焦磷酸(Isopentenyl diphosphate，IPP)及其異構(gòu)體二甲基丙烯焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)通過(guò)2條途徑合成，分別是位于質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途徑和位于胞質(zhì)的甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑[8-9]。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DXP)合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)是MEP途徑中的第一個(gè)酶，催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛生成DXP[10-12]。許多研究表明，DXS是MEP代謝通路的關(guān)鍵酶，也是IPP和DMAPP生物合成途徑的限速酶[13]。

試驗(yàn)表明，在植物中過(guò)量表達(dá)DXS基因?qū)е骂惡}卜素、葉綠素和其他萜類化合物的含量升高[14]。因?yàn)镸EP途徑在許多致病細(xì)菌和光合真核生物中是必不可少的，但在動(dòng)物和人體中不存在該代謝途徑，因此，該代謝途徑的基因和酶是開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物和除草劑的靶點(diǎn)[15-18]。研究表明，DXS可以作為靶向作用位點(diǎn)應(yīng)用于番茄[14]和馬鈴薯塊莖[19]異戊二烯類物質(zhì)的調(diào)控，并且馬鈴薯StDXS1基因在抗馬鈴薯晚疫病中發(fā)揮一定作用[20]，說(shuō)明DXS基因可能在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗生物及非生物脅迫中發(fā)揮一定的作用。

紅花(CarthamustinctoriusL.)，別名紅藍(lán)花、刺紅花、草紅花，是菊科紅花屬1年生雙子葉草本植物，紅花作為紅花屬中唯一的栽培種，是集油用、藥用和工業(yè)用于一體的特種經(jīng)濟(jì)作物[21]。目前，從紅花中分離到的代謝物超過(guò)100種，其中主要包括黃酮、生物堿、有機(jī)酸和炔烴類化合物，其中，從紅花管狀花分離到的炔烴類化合物有13種，這類化合物具有很好的抗抑郁活性[22]，但到目前為止，關(guān)于紅花萜類代謝生物合成相關(guān)基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心藥用植物研究室以豫紅花1號(hào)為材料，構(gòu)建了紅花三代測(cè)序全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(數(shù)據(jù)尚未公開(kāi)發(fā)表)，以此為基礎(chǔ)，通過(guò)RT-PCR方法克隆到紅花DXS基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為CtDXS1，對(duì)其序列及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，并對(duì)其非生物脅迫及激素處理響應(yīng)進(jìn)行相關(guān)研究，通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行異源表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生目的蛋白，為深入研究紅花萜類化合物的生物合成機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 紅花品種豫紅花1號(hào)及管狀花顏色為白色(W)、黃色(Y)、橙色(O)、紅色(R)的紅花品系均來(lái)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，大腸桿菌菌株DH5α、大腸桿菌表達(dá)菌株Transetta(DE3)和表達(dá)載體pET28a為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心保存。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒為華越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、DNA凝膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品; 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Sigma公司；引物合成和DNA測(cè)序分析由河南尚亞生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料種植及取樣 豫紅花1號(hào)及管狀花顏色為白色(W)、黃色(Y)、橙色(O)、紅色(R)的紅花品系種植于河南省農(nóng)科院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地，自然條件下生長(zhǎng)。以豫紅花1號(hào)為材料進(jìn)行基因組織特異性表達(dá)分析，紅花生長(zhǎng)至蓮座期取葉片；生殖生長(zhǎng)期取根、莖、葉和苞片，并在管狀花從花冠總苞片露出的第1、3、4、7天取管狀花，分別標(biāo)為S1、S2、S3、S4期；以生長(zhǎng)一致的不同花色紅花品系頂果球?yàn)椴牧?，取開(kāi)花第3天的管狀花進(jìn)行不同花色紅花基因表達(dá)分析。所有組織部位和樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，將采集的樣品立即放入液氮中保存，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)銻NA提取。

1.2.2 樣品處理 將豫紅花1號(hào)分別播種于1/2濃度的Hoagland標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液和培養(yǎng)缽中，基質(zhì)為泥炭土∶蛭石=1∶1，光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)條件設(shè)置為(26±1)℃、16 h/8 h(光照/黑暗)；待紅花幼苗生長(zhǎng)至兩葉時(shí)，用20% PEG-6000對(duì)水培紅花幼苗進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，用低溫(4 ℃)、茉莉酸甲酯(MeJA，100 μmol/L)、脫落酸(ABA，150 μmol/L)和赤霉素(GA3，100 μmol/L)對(duì)土培紅花幼苗進(jìn)行噴施處理，以噴施溶劑(10%乙醇)作為對(duì)照，于處理后0、3、6、12、24 h取葉片，并立即置入液氮中保存，轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA提取，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3CtDXS1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆 根據(jù)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心藥用植物研究室構(gòu)建的紅花三代測(cè)序全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，以豫紅花1號(hào)蓮座期幼苗為材料，按照華越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA為模板進(jìn)行CtDXS1基因全長(zhǎng)克隆。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，含2×PCR buffer for KOD FX 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTP 5 μL，cDNA模板1 μL，KOD FX 1 μL，ddH2O 16 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性2 min；98 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,68 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。將目的片段回收并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表1 引物序列

1.2.4 CtDXS1蛋白生物信息學(xué)分析 通過(guò)在線軟件ProtParam對(duì)CtDXS1蛋白的氨基酸組成、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等參數(shù)進(jìn)行分析；CtDXS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)ExPASy中的SOPMA工具完成；通過(guò)SWISS-MODEL在線軟件對(duì)CtDXS1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模預(yù)測(cè)；通過(guò)TMHMM Server v2.0對(duì)CtDXS1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用SignalP-5.0 server對(duì)CtDXS1蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用TargetP-2.0 Prediciton對(duì)CtDXS1蛋白的亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用NCBI中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(Conserved domain database,CDD)對(duì)CtDXS1蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；以CtDXS1蛋白序列為模板，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLASTP模塊進(jìn)行比對(duì)分析，找出擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)、苜蓿(Medicagotruncatula)、黃花蒿(Artemisiaannua)等物種中CtDXS1蛋白的同源序列，利用DNAMAN對(duì)CtDXS1蛋白與其他物種的同源蛋白進(jìn)行同源性分析；通過(guò)MEGA 7.0軟件中的Neighbor-joining構(gòu)建CtDXS1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并通過(guò)Bootstrap方法對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行檢測(cè)，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.2.5CtDXS1基因在不同組織和不同脅迫時(shí)間的表達(dá)分析 不同處理樣品總RNA的提取參照越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)完成，按照天根生物科技有限公司的Fast Quant RT Super Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)CtDXS1基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，以Ct60s作為內(nèi)參基因，引物序列如表1所示，熒光定量PCR反應(yīng)參照天根生物科技公司的Super Real Pre Mix(SYBR Green)試劑盒進(jìn)行，擴(kuò)增體系20 μL：2×SuperReal Pre Mix 10 μL、上游引物(10 μmol/L)1.0 μL、下游引物(10 μmol/L)1.0 μL、cDNA模板5 μL、ddH2O 3 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR在Eppendorf Mastercycler ep Realplex 2.2 Detection System上進(jìn)行。相對(duì)定量分析采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

1.2.6CtDXS1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及異源表達(dá) 以連接pMD19-T載體并測(cè)序驗(yàn)證過(guò)的CtDXS1質(zhì)粒為模板，用CtDXS1-PE-F、CtDXS1-PE-R引物擴(kuò)增CtDXS1基因全長(zhǎng)，回收目的片段，用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切目的片段和pET28a原核表達(dá)載體，酶切產(chǎn)物純化后，用T4連接酶將酶切目的片段和酶切載體進(jìn)行連接，構(gòu)建pET28a-CtDXS1原核表達(dá)載體。將pET28a-CtDXS1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，通過(guò)酶切、測(cè)序?qū)?gòu)建的原核載體進(jìn)行鑒定，將鑒定正確的pET28a-CtDXS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliTransetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性克隆單菌落，接種于10 mL含50 mg/L羧芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)6 h，然后按照1∶100比例，加入到200 mL新鮮含有50 mg/L羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，將搖床溫度調(diào)至16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，以16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h的E.coli(pET28a)作為空白對(duì)照。誘導(dǎo)結(jié)束后，取1 mL菌液，10 000×g離心1 min，收集菌體，加50 μL超純水重懸，作為總蛋白待檢。其余菌液通過(guò)10 000×g離心1 min收集菌體，用20 mL Binding buffer(50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，10 mmol/L MgCl2，10%甘油，pH值7.4)洗滌收集2次，最后用15 mL Binding buffer重懸，將菌體置于冰上超聲破碎。破碎菌液于4 ℃、10 000×g離心20 min，將上清液經(jīng)HisTrap HP純化柱純化、Washing buffer(50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，300 mmol/L NaCl，20、50、100、300 mmol/L咪唑，10 mmol/L MgCl2，pH值7.4)梯度漂洗和Elution buffer(50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH值7.4)洗脫，洗脫液利用PD10柱進(jìn)行脫鹽，利用Assay buffer(50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，100 mmol/L KCl，20 mmol/L MgCl2，10%甘油，2 mmol/L DTT)進(jìn)行洗脫，洗脫液通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花CtDXS1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)紅花三代測(cè)序全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及注釋分析設(shè)計(jì)紅花DXS基因cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，以紅花蓮座期葉片為材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，利用PCR方法擴(kuò)增得到2 100 bp左右的片段(圖1)。將PCR產(chǎn)物回收連入pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)NCBI比對(duì)分析和Open Reading Frame Finder分析，確定該序列為DXS基因cDNA全長(zhǎng)，命名為CtDXS1，序列全長(zhǎng)為2 136 bp，編碼711個(gè)氨基酸。

M:DL2000 plus DNA marker；1:CtDXS1基因PCR產(chǎn)物

2.2 CtDXS1蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)分析

通過(guò)Protparam對(duì)CtDXS1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性狀進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，CtDXS1蛋白分子質(zhì)量為76 503.10 u，理論等電點(diǎn)為6.35，分子式為C3 384H5 328N952O1 012S30；蛋白質(zhì)氨基酸組成分析表明，CtDXS1蛋白中甘氨酸含量最高，為10.4%，色氨酸含量最低，為0.3%；不穩(wěn)定系數(shù)為40.07，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)86.33，總平均親水性GRAVY為-0.108，為親水性蛋白。利用SignalP-5.0 server預(yù)測(cè)CtDXS1無(wú)信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白；利用TMHMM Server v2.0對(duì)CtDXS1的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CtDXS1沒(méi)有跨膜區(qū)域，為非跨膜蛋白；利用TargetP-2.0 Prediciton對(duì)CtDXS1蛋白的亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，CtDXS1定位于葉綠體，并且在N端區(qū)域有50個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，這與DXS參與的MEP途徑發(fā)生在質(zhì)體中的現(xiàn)象相吻合。

2.3 CtDXS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)ExPASy中的SOPMA和SWISS-MODEL分別對(duì)CtDXS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，CtDXS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(α-helices)組成，共有286個(gè)，占比為40.23%；其次是無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)，共有270個(gè)，占比為38.54%；延伸鏈(Extended strand)97個(gè)，占比為13.64%；β-折疊(β-turn)54個(gè)，占比為7.59%。推測(cè)α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈和β-折疊散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中(圖2)。CtDXS1的三維結(jié)構(gòu)模型結(jié)果表明，CtDXS1是由2個(gè)單體并行排列形成二聚體(圖3)。

藍(lán)色:α-螺旋；綠色:β-折疊；紅色:延伸鏈；紫色:無(wú)規(guī)則卷曲

圖3 CtDXS1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 CtDXS1氨基酸序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用NCBI的蛋白質(zhì)保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)(Conserved domain database,CDD)對(duì)CtDXS1蛋白進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè)，CtDXS1蛋白具有典型的轉(zhuǎn)酮醇酶的保守域，屬于轉(zhuǎn)酮醇酶超家族(圖4)，含焦磷酸硫胺素結(jié)合位點(diǎn)GDG(X)8E(X)4A(X)11NDN和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域DRAGX28PXD(圖5)。

多重序列比對(duì)表明，CtDXS1氨基酸序列與擬南芥、煙草、水稻、苜蓿、黃花蒿DXS1氨基酸序列相似性分別為80.56%、84.24%、82.50%、84.46%、93.31%，說(shuō)明CtDXS1氨基酸序列與其他植物中DXS1氨基酸序列間具有較高的同源性(圖5)。

TPP:焦磷酸硫胺素

為進(jìn)一步分析DXS1基因與其他植物DXS1基因的進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索等方式，收集到其他植物的26條DXS蛋白序列，進(jìn)化樹(shù)分析表明，這些植物DXS序列可以聚類為3個(gè)分支，分別為CladeⅠ、CladeⅡ和Clade Ⅲ，CtDXS1屬于CladeⅠ分支，與來(lái)自黃花蒿、橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)、蓖麻(Ricinuscommunis)和苜蓿中的DXS基因親緣關(guān)系較近(圖6)， 擬南芥和苜蓿中DXS1主要行使看家基因的功能，參與葉綠體的發(fā)育和葉綠素的合成過(guò)程，但并不參與次生代謝物的合成，這暗示CtDXS1可能主要參與紅花葉綠體的發(fā)育。

虛線框代表焦磷酸硫胺素結(jié)合位點(diǎn),實(shí)線框代表轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域

2.5 CtDXS1基因表達(dá)特性分析

分別以紅花根、莖、葉、花和苞片等5個(gè)組織部位為材料研究CtDXS1基因的組織表達(dá)特性，其中，將葉分為蓮座期葉和生殖生長(zhǎng)期的葉，管狀花根據(jù)發(fā)育時(shí)期分為S1、S2、S3和S4四個(gè)時(shí)期。結(jié)果表明，CtDXS1基因在苞片中表達(dá)量最高，其次是葉和莖，在根和花中也有表達(dá)但表達(dá)量相對(duì)較低，蓮座期葉較生殖生長(zhǎng)期葉表達(dá)量高；不同發(fā)育時(shí)期管狀花中CtDXS1基因的定量分析表明，隨著發(fā)育時(shí)期的延長(zhǎng)，紅花管狀花中CtDXS1基因表達(dá)量呈明顯下降趨勢(shì)(圖7A)。

為了進(jìn)一步研究CtDXS1基因在不同花色紅花中的表達(dá)量是否有差異，選取開(kāi)花期S2期白色(W)、黃色(Y)、橙色(O)和紅色(R)紅花管狀花進(jìn)行CtDXS1基因定量分析，結(jié)果表明，CtDXS1基因在黃色紅花中表達(dá)量最高，在白色、橙色和紅色紅花中表達(dá)量相對(duì)較低(圖7B)。

GbDXS1:Ginkgo biloba DXS1,AAS89341.1;GbDXS2:AAR95699.1;AtDXS1:AAN86173.1;AtDXS2:ACI49774.1;NtDXS1:CBA12009.1;NtDXS2-1:AFM78321.1;NtDXS2-2:NP_001312088.1;OsDXS1:NP_001055524.1;OsDXS2:NP_001059086.1;OsDXS3:BAA83576.1;CrDXS1:Catharanthus roseus DXS1,CAA09804.2;MtDXS1:CAD22530.1;MtDXS2:AAD56390.2;AaDXS1:AAD56390.2;AaDXS2:PWA79560.1;AaDXS3:PWA60387.1;AaDXS4:PWA43715.1; ZmDXS1:Zea mays DXS1,ACT32136.1;ZmDXS2:ADN22972.1;ZmDXS3:ABP88135.1;HbDXS1:AAS94123.1;HbDXS2:ABF18929.1;RcDXS1:XP_002516843.1;RcDXS2:XP_002533688.1;RcDXS3:XP_002514364.1

A:CtDXS1基因在不同組織中的表達(dá)模式分析(R:根,S:莖,SL:蓮座期葉,RL:生殖生長(zhǎng)期葉,B:苞片,S1:開(kāi)花后1 d的管狀花，S2:開(kāi)花后3 d的管狀花,S3:開(kāi)花后5 d的管狀花,S4:開(kāi)花后7 d的管狀花)；B:CtDXS1基因在管狀花顏色為白色(W)、黃色(Y)、橙色(O)和紅色(R)紅花品種中的表達(dá)分析

2.6 CtDXS1基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證CtDXS1是否在植物非生物脅迫中起作用，對(duì)紅花幼苗進(jìn)行干旱和4 ℃低溫處理，以相同培養(yǎng)條件不做處理的紅花作為對(duì)照，在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)取樣，提取RNA后進(jìn)行熒光定量PCR分析。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，模擬干旱和低溫都能不同程度誘導(dǎo)CtDXS1基因的表達(dá)。20% PEG-6000誘導(dǎo)產(chǎn)生的干旱脅迫條件下，CtDXS1基因表達(dá)量在處理6 h后達(dá)到高峰，隨后下降(圖8A)。4 ℃低溫處理后，CtDXS1基因表達(dá)量在處理3 h后最高，隨后降低并趨于穩(wěn)定(圖8B)。

**表示與對(duì)照相比差異顯著(P<0.01)，下同

2.7 CtDXS1基因在不同激素誘導(dǎo)下的表達(dá)分析

為了研究CtDXS1基因表達(dá)是否受激素調(diào)控，對(duì)紅花幼苗進(jìn)行MeJA、GA3和ABA處理，通過(guò)熒光定量PCR對(duì)其表達(dá)變化進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，MeJA對(duì)CtDXS1基因的表達(dá)具有一定誘導(dǎo)作用，其表達(dá)量在激素處理6 h達(dá)到高峰，隨后下降；而GA3和ABA對(duì)CtDXS1基因表達(dá)具有抑制作用，GA3處理3 h，CtDXS1基因表達(dá)量降至最低，隨后上升，但仍低于對(duì)照，而ABA處理12 hCtDXS1基因表達(dá)量降至最低(圖9)。

圖9 CtDXS1基因在不同激素處理下表達(dá)變化

2.8 CtDXS1基因的原核表達(dá)分析

將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET28a-CtDXS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliTransetta(DE3)后，通過(guò)加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，在16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在76 ku處有大量目的蛋白條帶，而空白對(duì)照載體沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶，根據(jù)pET28a質(zhì)粒的His標(biāo)簽對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)SDS-PAGE對(duì)純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其大小與預(yù)測(cè)的CtDXS1大小相符，確認(rèn)其為目的蛋白(圖10)。

M:蛋白質(zhì)Marker,1:pET28a空載體,2:pET28a-CtDXS1重組蛋白,3:純化后的CtDXS1重組蛋白

3 結(jié)論與討論

MEP是位于植物質(zhì)體中異戊二烯生物合成途徑，DXS是該途徑中的第一個(gè)限速酶[23]，DXS在植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)方面都起著重要作用，另外，DXS也是次生代謝產(chǎn)物葉綠素、維生素E、類胡蘿卜素、赤霉素和萜類等化合物的生物合成途徑的第一限速酶[24]。DXS基因最早從大腸桿菌(E.coli)[25]中分離出來(lái)，截至目前，已經(jīng)從100多種植物中克隆到了DXS基因[26]，但尚未見(jiàn)到紅花中DXS基因的相關(guān)報(bào)道。為了研究紅花DXS基因序列特征，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從紅花葉片中克隆得到1條開(kāi)放閱讀框?yàn)? 136 bp的紅花DXS基因序列(CtDXS1)，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，分析表明，CtDXS1基因具有DXS家族必需的質(zhì)子傳遞域和硫胺焦磷酸結(jié)合域，并且在不同物種中高度保守。

目前發(fā)現(xiàn)的MEP途徑相關(guān)蛋白酶都定位于質(zhì)體中，對(duì)其他DXS基因的研究發(fā)現(xiàn)，大部分DXS蛋白在N端都有30～60個(gè)氨基酸殘基組成的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽[27-29]，如在番茄中轉(zhuǎn)化番茄DXS融合GFP表明，該蛋白質(zhì)定位于葉綠體[30]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，CtDXS1蛋白在N端有50個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，這與DXS定位于質(zhì)體相一致，暗示CtDXS1基因也能參與葉綠體的形成，對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育以及次生代謝產(chǎn)物的合成具有很重要的作用。

植物DXS家族基因根據(jù)其結(jié)構(gòu)及功能可以分為3種類型。Ⅰ型為管家基因，其所編碼的酶催化前體物質(zhì)形成葉綠素、類胡蘿卜素等與光合有關(guān)的萜類物質(zhì)，如擬南芥中AtDXS1(CLA1)基因功能缺失突變體表現(xiàn)出白化現(xiàn)象[31]。Ⅱ型基因編碼植物特異性次生代謝產(chǎn)物，如苜蓿MtDXS2可能跟植物的防御功能有關(guān)[32]，Ⅲ型基因所編碼酶的功能尚不清晰。本研究中，利用其他植物DXS家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，CtDXS1與其他物種的DXS1聚為一類，并且與黃花蒿AaDXS1親緣關(guān)系最近。通過(guò)不同組織部位表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CtDXS1基因主要在莖、葉、苞片等葉綠素較多的部位表達(dá)，這暗示著CtDXS1基因可能參與紅花葉綠素的合成。另外，通過(guò)不同花色紅花中CtDXS1基因的定量分析發(fā)現(xiàn)，CtDXS1基因在黃色紅花中表達(dá)量較高，說(shuō)明CtDXS1基因可能也參與紅花類胡蘿卜素的生物合成。

研究表明，DXS受多種激素和環(huán)境信號(hào)因子的調(diào)控[33]，如赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯和油菜素內(nèi)脂處理鐵皮石斛后，原球莖中DXS的基因轉(zhuǎn)錄水平升高[34]；在白木香(Aquilariasinensis)中的研究發(fā)現(xiàn)，AsDXS1受物理、化學(xué)和H2O2的調(diào)控，AsDXS2和AsDXS3只受物理和化學(xué)調(diào)控而不受H2O2調(diào)控，但MeJA處理能夠誘導(dǎo)3個(gè)基因的表達(dá)[35]，說(shuō)明不同DXS基因?qū)に丶案鞣N環(huán)境、脅迫的響應(yīng)不同。本研究表明，CtDXS1在受到干旱和低溫脅迫時(shí)表達(dá)量上升，茉莉MeJA能誘導(dǎo)CtDXS1基因的表達(dá)，而GA3和ABA對(duì)CtDXS1基因表達(dá)有一定的抑制作用。在玫瑰的研究中發(fā)現(xiàn)，DXS基因表達(dá)與花朵發(fā)育程度密切相關(guān)，隨著花朵的衰敗，表達(dá)量降低[36]。本研究分析開(kāi)花后不同時(shí)間的紅花花朵CtDXS1基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，隨著紅花冠狀花的衰老，CtDXS1基因表達(dá)量也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

利用原核表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生目的蛋白，通過(guò)體外酶活試驗(yàn)手段對(duì)其催化功能進(jìn)行研究已成為鑒定植物次生代謝相關(guān)酶功能的主要手段[37]，本研究通過(guò)構(gòu)建CtDXS1原核表達(dá)載體將其在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將目的蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)檢測(cè)與目的蛋白大小一致，為后續(xù)CtDXS1的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。

綜上，從紅花中克隆得到CtDXS1基因的全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度2 136 bp，編碼711個(gè)氨基酸，該蛋白質(zhì)具有典型的轉(zhuǎn)酮醇酶家族功能域。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，CtDXS1與來(lái)自黃花蒿的DXS親緣關(guān)系最近，屬于DXS基因家族的Ⅰ類基因。CtDXS1基因在苞片中表達(dá)量最高，其次是葉和莖，在其他組織部位表達(dá)量較低。CtDXS1基因在管狀花為黃色的紅花中表達(dá)量較高。干旱、低溫脅迫能夠誘導(dǎo)CtDXS1基因表達(dá)上調(diào)；MeJA誘導(dǎo)CtDXS1基因的表達(dá)，而GA3和ABA對(duì)CtDXS1基因表達(dá)有一定的抑制作用。另外，通過(guò)原核表達(dá)誘導(dǎo)獲得并純化了目的蛋白。